青杄转录因子基因PwNF-YB8的克隆与功能分析

【目的】NUCLEAR FACTOR Y(NF-Y)转录因子在真核生物中广泛存在,通常由NF-YA、NF-YB和NFYC 3个亚基形成异源三聚体,来结合下游靶基因启动子中的CCAAT顺式作用元件,进而调控植物的生长发育进程,并参与植物非生物逆境胁迫过程。本研究对青杄中PwNF-YB8基因的表达特性及功能进行分析,揭示其参与的生理过程及对非生物逆境胁迫的响应。【方法】根据实验室前期EST测序及RNA-seq转录组数据分析结果获得青杄NF-Ys家族基因序列,克隆得到PwNF-YB8的cDNA序列,并对其编码蛋白进行序列特征和进化树分析。采用qRT-PCR分析PwNF-YB8在不同组织和花粉萌发过程中的表达特性,以及高温、盐胁迫、甘露醇、ABA处理后的表达变化。亚细胞定位揭示PwNF-YB8在细胞中发挥功能的场所。通过酵母双杂交试验、双分子荧光互补试验分别检测PwNF-YB8的转录激活活性以及与PwHAP5的互作情况。农杆菌介导花序侵染法转化野生型拟南芥(WT),获得纯合的PwNF-YB8过表达株系。利用CRISPR/Cas 9技术获得其同源基因AtNF-YB8的突变体。甘露醇和盐处理后测定野生型(WT)、空载体(VC)、突变体株系(nfyb8-cas9#1/12)和过表达株系(L4、L5)的萌发率、幼苗根长,分析比较不同株系对于渗透胁迫和盐胁迫的耐受能力。【结果】PwNF-YB8基因的开放阅读框为489 bp,编码162个氨基酸,具有典型的NF-YB保守结构域,并且与白云杉同源基因具有较近的亲缘关系。SqRT-PCR和qRT-PCR结果表明在青杄的根、茎、针叶和花粉中均能检测到PwNF-YB8的表达,其在花粉中的表达量最高。亚细胞定位试验结果显示,PwNF-YB8定位于细胞核、细胞质中。酵母自激活试验显示PwNF-YB8自身无转录激活活性。进一步对青杄幼苗进行高温(42℃)、盐胁迫、甘露醇和脱落酸处理后发现,PwNF-YB8对干旱和盐2种非生物逆境处理明显响应。PwNF-YB8参与了花粉萌发过程,在花粉萌发36 h时表达量最高。酵母双杂交和双分子荧光互补试验证明PwNF-YB8能够与NF-YC亚基中的PwHAP5互作,可能共同参与花粉管发育调控。甘露醇或盐处理下,异源过表达PwNF-YB8基因的拟南芥种子萌发率与野生型差异不显著,但其根长表现出一定的生长优势。【结论】青杄PwNF-YB8能够与PwHAP5互作,参与花粉萌发和花粉管生长过程,并在干旱、盐胁迫响应中发挥作用。     

基于苦楝转录组测序的SSR分子标记开发

【目的】基于转录组测序数据开发苦楝SSR标记,为苦楝种质资源的选育、评价和遗传改良提供理论基础和科学依据。【方法】利用Illumina Hi Seq~(TM)2500平台对苦楝叶片进行高通量测序,分别利用Trinity、MISA软件对转录组数据进行拼接组装、序列检索及SSR分布类型和特征分析。采用Primer 3软件设计合成100对SSR引物,分别用2%琼脂糖凝胶电泳和PAGE凝胶电泳进行初步筛选和多态性筛选。【结果】共获得Unigenes 20 077条,平均长度为1 431.82 bp,N50为1 955 bp;对Unigenes进行SSR位点的发掘和分析,发现4 116条Unigenes序列中含有5 469个SSR位点,SSR的发生频率为20.50%,平均分布距离为8.74 kb;单、二、三核苷酸重复单元分别占总SSR的50.23%、24.43%和22.11%; SSR重复单元以6～10次重复的最多,占总数的51.27%。筛选出16对多态性引物并进行PCR扩增,共检测到56个等位基因片段,平均每个位点含3.5个,平均有效等位基因数为2.31个,平均Shannon多样性指数I为0.861,平均多态性信息含量PIC为0.507。【结论】苦楝转录组SSR位点具有较高的出现频率和分布密度,基元类型和重复次数相对较高,具有高多态性的潜能,可以进行有目的的引物设计和开发。开发的16对SSR引物在苦楝上可检测到较高的多态信息含量,进一步丰富了楝科现有SSR标记数据库资源,可为楝科植物在基因组水平上的遗传多样性分析和分子辅助育种等提供参考。     

油茶炭疽病菌果生刺盘孢效应子的筛选

【目的】采用生物信息学研究方法,筛选分析果生刺盘孢效应子,并验证其功能,为其致病相关基因研究提供理论依据,同时为油茶病害管理提供参考。【方法】对果生刺盘孢非侵染期(分生孢子)和侵染时期(油茶叶片病斑组织)进行RNA-seq测序,并利用生物信息分析软件BUSCA、Target P、big-PI Predictor和GO、KEGG、PHI数据库分析转录组数据,选出符合条件的候选效应子,再利用qRT-PCR技术对效应子进行相对定量分析;克隆候选效应子全长基因,通过烟草瞬时表达系统和DAB染色验证相应基因功能。【结果】1)转录组结果数据显示,侵染时期相对于非侵染时期有7 850个差异表达基因。对差异表达基因的编码蛋白进行预测分析,345个为经典分泌蛋白,占总数的4.39%。经典分泌蛋白氨基酸长度在各区间段分布较为均匀,而符合效应子筛选条件(300 aa)的蛋白约占经典分泌蛋白总数的36%,数量相对较少。信号肽长度集中在18～20 aa(占48.7%),信号肽切割位点以SPase Ⅰ型为主(占88.41%)。KEGG功能富集分析得到164条Pathway信息,多为真菌代谢途径、次生代谢产物、淀粉和蔗糖代谢相关的通路。PHI致病菌数据库同源比对结果表明,在经典分泌蛋白中含有80条与真菌致病力相关的基因,其中包括1个已知效应子。以氨基酸长度300和半胱氨酸残基数≥4为筛选条件,并过滤已经注释过功能的蛋白后,在果生刺盘孢中筛选出17个候选效应子。2)随机抽样选取9个候选效应子做qRTPCR分析,结果显示9个基因均为上调表达,与转录组数据结果相符。3)克隆出4个候选效应子,并通过烟草瞬时表达系统和DAB染色,验证出4个候选效应子均能引起植物细胞坏死。【结论】果生刺盘孢在侵染油茶时期有多个效应子表达,而在分生孢子时期此类蛋白多为不表达或少量表达,这验证了效应子是植物与病原菌相互作用的关键因素。     

珍稀濒危植物金丝李种子休眠解除的转录组分析

[目的]探讨珍稀濒危植物金丝李种子休眠解除的分子机理,挖掘其休眠解除相关的候选基因,以期为金丝李的育种、保护和利用提供有益参考。[方法]以新鲜成熟种子(OS)、播种60 d未萌发的种子(UG)及播种60 d已萌发的种子(GS)的胚和胚乳为材料进行转录组测序。[结果](1)从3组样本中得到120 040个unigenes,其中,56 224个unigenes在KEGG数据库中获得注释;(2)GS相对OS有1 174个unigenes上调表达,2 232个下调,UG相对OS有849个unigenes上调,1 926个下调,GS相对UG有814个unigenes上调,670个下调;(3)筛选出差异量较大的122个基因中,显著上调的基因涉及钙信号、次生代谢产物合成、核糖体和植物激素信号转导等通路,显著下调的基因涉及糖酵解/糖异生、脂肪酸合成与降解、内质网中的蛋白质加工和氨基酸合成等通路;(4)筛选出40个涉及到与ABA、GA、生长素和乙烯等激素相关的DEGs,其中,ZEP、GA2ox1、GA2ox3、GAI、GID1、SnRK2.2和ACO1在种子休眠解除时显著下调表达,而CYP707A2、GA20ox1和GA3ox2显著上调表达。[结论]推测金丝李种子休眠解除过程中,通过上调钙信号、次生代谢产物合成等通路,下调糖酵解/糖异生、脂肪酸合成与降解等通路,同时伴随着上调GA合成及ABA分解的相关基因,下调ABA合成及GA分解的相关基因,与有关转录因子等调控网络相配合以打破休眠。     

甜菜干旱胁迫响应研究进展

由于全球变暖和水资源短缺日益加剧,干旱胁迫已经成为非生物胁迫中影响甜菜生长及产业发展的最主要因素.本文从干旱胁迫下甜菜生理生化、基因组学、转录组学、蛋白组学等方面的响应和采用叶面喷施L-鸟氨酸、脯氨酸、外源茉莉酸甲酯、富勒烯醇纳米颗粒及营养物质等外源物质缓解干旱胁迫等方面进行概述,重点论述了应用分子技术在甜菜干旱胁迫响...     

烟草转录因子NtMYB4 a响应干旱、低温和茉莉酸甲酯胁迫的功能分析

MYB转录因子是植物体内最大的一类转录因子,在植物应对非生物胁迫中发挥重要作用.为探讨烟草NtMYB4a基因在响应干旱、低温和茉莉酸甲酯胁迫下的功能,以NtMYB4a基因的过表达和敲除突变体及野生型烟株为材料,采用RT-qPCR技术分析了干旱、低温和茉莉酸甲酯处理0、1、3、6、12、24和48 h后烟草叶片中Nt-M...     

MYC2转录因子在植物中的功能研究进展

MYC2(Myelocytomatosis proteins 2）是一类b HLH家族转录因子，是JA信号途径中的主要调控因子。MYC2通过转录调控下游目标基因的转录和表达，参与植物逆境防御、生长发育及次生代谢等进程。MYC3/4作为JA信号的次级调控因子可与MYC2协同作用。目前对MYC2的功能研究较为深入和广泛。本文综述了MYC2的结构特征及其在植物激素信号传导、逆境防御、生长发育和次生代谢中的调控机制，为进一步深入探讨MYC2的分子功能提供理论基础。