坛紫菜转录因子NhbZIP1克隆和功能验证

高温是制约坛紫菜(Neoporphyra haitanensis)产业发展的主要因素之一,阐明坛紫菜高温胁迫应答机理对耐高温品种选育至关重要。人们已分离多个坛紫菜抗逆相关基因,但尚不清楚这些基因的表达调控机制。本研究通过分子生物学和生物信息学技术分离了坛紫菜转录因子NhbZIP1基因。该基因开放阅读框长825 bp,编码274个氨基酸。从开放阅读框推导的氨基酸序列有5个低复杂度区域和1个BRLZ结构。其中,BRLZ是bZIP家族的保守结构域,含有一个α卷曲螺旋结构(121~171 aa)。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现,NhbZIP1受高温胁迫显著诱导。为进一步阐明NhbZIP1的功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中。结果显示,高温胁迫下转基因藻株生物量始终高于野生型,且随处理时间增加差异越来越显著。转基因藻株中热激蛋白家族和抗氧化系统相关基因的表达量显著高于野生型。研究表明,NhbZIP1激活下游抗逆基因表达,在坛紫菜应答高温胁迫中发挥重要作用。研究结果有助于阐明bZIP调控坛紫菜响应高温胁迫的分子机制,为耐高温新品种选育提供了基础信息。     

一步法构建莱茵衣藻叶绿体表达载体

为简化莱茵衣藻叶绿体表达载体构建步骤,将莱茵衣藻叶绿体中表达所需的DNA 元件组合,构建入可一步 TA 克隆插入靶基因的载体pTBNK,可直接用于在莱茵衣藻叶绿体表达靶基因。将EGFP 克隆至表达载体pTBNK,经 蓝白班筛选获得阳性转化子pTBNK-EGFP,通过基因枪转化衣藻叶绿体并获得阳性克隆。通过PCR 鉴定,EGFP 成 功整合至衣藻叶绿体基因组中。     

衣藻肌动蛋白基因的克隆及核苷酸序列分析

提取衣藻总 DNA,以此为模板并参照肌动蛋白基因编码区端的序列合成寡聚核苷酸引物,进行聚合酶链式反应,扩增到一个1.2 kb 的 DNA 片段.将此片段进行克隆并经分子探针杂交,证明此片段为衣藻肌动蛋白基因.经限制性核酸内切酶处理,构建了衣藻肌动蛋白基因的物理图谱.根据物理图谱进行亚克隆以后,测得了编码区5′端的618个核苷酸的顺序.衣藻肌动蛋白基因的编码序列与高等植物之间的同源性大于90%,高于与高等动物、原生动物及真菌的同源性.但在基因的结构上,衣藻肌动蛋白基因又明显地不同于高等植物,在已经测定的基因片段上,没有发现内含子的存在.经限制性内切酶片段多态性分析,衣藻中含有一个肌动蛋白基因拷贝.     

3种沉水植物对5种富营养化藻类生长的化感效应

通过连续滴加培养液的方式研究了狐尾藻Myriophyllum spicatum、马来眼子菜Potamogeton malaianus、苦草Vallasneria asiatica 3种沉水植物对5种富营养化淡水藻类:衣藻Chlamy domonas sajao、铜绿微囊藻Microcystis aeruginosa、纤细席藻Phormidium tenue、四尾栅藻Scenedesmus quaclricauda、小球藻Chlorella pyrenoidosa的化感效应.研究结果表明:(1)马来眼子菜培养液对铜绿微囊藻、小球藻、衣藻和四尾栅藻的生长都具有明显的抑制作用,但对纤细席藻生长没有影响;(2)苦草培养液对小球藻、衣藻和纤细席藻的生长都具有明显的抑制作用,对四尾栅藻生长具有促进作用,对铜绿微囊藻生长没有影响;(3)狐尾藻培养液对小球藻、衣藻的生长都具有明显的抑制作用,对铜绿微囊藻生长具有促进作用,对四尾栅藻、纤细席藻生长没有影响.     

美人蕉种植根区水对藻类生长的影响

通过取用美人蕉(Canna indica)种植根区水置于光照培养箱中对小球藻(Chlorella vulgaris)和卵形衣藻(Chamydom onas ovalis)进行培养和观察,获得两种藻类的生长数据。结果显示:根区水在6 d对小球藻的化感效应为-0.7331,对卵形衣藻则为-0.4408;小球藻试验组与对照组的细胞数量在2~6 d差异显著(P<0.05),而卵形衣藻的细胞数量在5~6 d出现显著差异(P<0.05)。显微镜观察还发现,试验组卵形衣藻部分细胞颜色变白、细胞器溶解,并出现胶群体,对照组没有发现这种现象。实验说明美人蕉根系能分泌一些化感物质影响藻类生长,化感物质对藻类的影响具有选择性。     

“ 细菌型”pepc2基因反向表达载体构建及在莱茵衣藻中表达

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC, EC 4.1.1.31)在植物碳代谢中处于代谢纽的关键位置,是调节细胞蛋白质和脂肪酸含量的关键酶,通过抑制pepc基因的表达,可以提高细胞的含油率。通过克隆莱茵衣藻“细菌型”pepc2基因的部分序列（简称Crpepc2）和莱茵衣藻融合启动子Hsp70A-RBCS2（简称HR）,将HR和Crpepc2片段插入pSP124s中,获得Crpepc2反向表达的莱茵衣藻高效表达载体pSP124s-HR-reve- Crpepc2。利用基因枪将pSP24s和pSP124s-HR-reve-Crpepc2分别转入莱茵衣藻cc-503藻株,得到空质粒型和反向型突变藻株。利用qPCR检测莱茵衣藻野生型、空质粒型和反向型藻株“细菌型”pepc2基因的相对表达量,结果表明空质粒的导入对莱茵衣藻pepc2基因的相对表达量影响很小,为野生型的92.95%;而反向型pepc2基因的导入明显降低了莱茵衣藻pepc2基因的相对表达量,仅为野生型的2.94%。该结果一方面说明我们建立了利用qPCR快速检测莱茵衣藻pepc2基因相对表达量的方法,另一方面也证明利用Crpepc2反向表达的方法（即“反向载体技术”）可以有效的抑制莱茵衣藻pepc2基因的表达,为进一步筛选稳定的含油量高的藻株奠定了良好的基础。     

含铁蛋白FAO1融合基因的衣藻核转化表达和分析

【目的】fao1编码Candida cloacae中一种含铁辅基的长链脂肪醇氧化酶。通过构建该基因的衣藻核转化表达载体进行转化,根据表达蛋白的生物活性判断fao1能否充分利用衣藻叶绿体中的铁元素行使功能;同时也为需铁固氮酶基因的研究提供方向。【方法】通过PCR把PsaD信号肽、fao1、His-tag标签融合,连接到pDBle载体上;采用玻璃珠转化法,将重组子导入莱茵衣藻（CW15）中;经博来霉素筛选后,获得转基因植株。运用PCR和RT-PCR法检测了转化衣藻,并且用亲和层析柱纯化蛋白,同时进行FAO1活性检测。【结果】重组质粒测序完全正确;PCR和RT-PCR检测转化衣藻基因组DNA和RNA,扩增片段与预期相符;转化衣藻FAO1蛋白纯化洗脱液使ABTS（2,2′-联氨-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺盐）底物反应变色。【结论】成功构建了信号肽、FAO1和His-tag融合基因的衣藻核转化表达载体,重组质粒已整合到莱茵衣藻基因组中,并成功转录,纯化的蛋白检测有活性。     

莱茵衣藻CrGPAT基因的克隆及分析

【目的】探究CrGPAT在莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)油脂合成中的作用。【方法】通过RT-PCR方法克隆了莱茵衣藻CrGPAT基因,对其理化性质、信号肽、蛋白结构域、高级结构进行分析,构建系统发育树。采用荧光定量PCR检测CrGPAT基因表达量。【结果】结果表明,CrGPAT基因编码区全长为1 233 bp,共编码410个氨基酸。GPAT相对分子质量为102 kDa,等电点为4.94,平均疏水性为0.805,脂肪系数为17.85,分子式为C₃₅₃₆H₅₈₄₁N₁₂₃₃O₁₄₄₂S₄₁₅,不稳定指数为45.30,属于不稳定蛋白质,为非分泌蛋白且不具有信号肽和蛋白跨膜区。二级结构预测表明CrGPAT蛋白由4种结构组成,其中α螺旋占43.17%,是CrGPAT蛋白最主要的二级结构。同时,系统发育分析表明,CrGPAT与团藻(Volvox)亲缘关系最近。【结论】CrGPAT能够在衣藻体内正常表达且在缺氮条件下表达量会显著提高,为进一步提高莱茵衣藻体内油...     

莱茵衣藻增殖 沉降与死亡过程对太湖底泥氮素释放的影响

以太湖梅梁湾为研究原型区域,采集水样和泥样,通过室内模拟实验,添加莱茵衣藻(Chlamydomonas Reinhardtii)于水-泥体系中,研究了莱莴衣藻增殖、沉降与死亡过程对底泥氮素释放的影响.结果表明,莱芮衣藻在大量增殖过程中伴随着藻体沉降,沉降过程中大部分藻体死亡,小部分藻体聚集在底泥表面,当养分增加时其再次增殖并悬浮;藻体增殖、沉降与死亡过程促进了底泥NH4+-N的释放;上覆水NH4+-N累积消耗量与底泥脲酶活性呈显著正相关关系.     

肿瘤坏死因子α单链抗体基因的优化及衣藻叶绿体表达载体的构建

通过在EMBL数据库中搜索鼠源TNF-α单链抗体基因同源性最高的人胚系抗体基因TNF-α-ScFv,进行人源化改造,并选择衣藻叶绿体偏爱的密码子对TNF-α-ScFv基因进行优化,随后构建带psbA启动子：TNF-α-ScFv：：psbA 3′终止子表达框的中间载体,再将psbA启动子：TNF-α-ScFv：：psbA 3′终止子表达框插入衣藻叶绿体表达载体p322中,通过PCR和酶切鉴定,确定已成功构建了TNF-α-ScFv基因的衣藻叶绿体表达载体。