绵羊瘤胃上皮细胞的体外分离培养、冻存及复苏方法

本研究旨在建立绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)的分离培养、冻存和复苏方法,为反刍动物瘤胃功能的研究和相关瘤胃疾病的发病机制研究提供功能性的细胞模型。以绵羊瘤胃为研究对象,采用胰蛋白酶连续消化法对瘤胃组织进行不同时间(40、30、20、10、10、8和5 min)的消化,并对每次消化后的瘤胃组织和消化液分别进行H.E染色分析和显微镜观察,以确定细胞开始收集及终止消化的时间,最后将收集的瘤胃上皮细胞进行原代培养。在传代培养时,运用差时消化法和差速贴壁法对ORECs进行纯化,并从细胞形态学、细胞生长曲线、角蛋白18(CK-18)免疫荧光染色和上皮细胞标志物E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶基因表达等方面对ORECs进行鉴定。然后设置不同体积配方的冻存液,将传代细胞进行冻存,通过检测复苏后的细胞活力和24 h贴壁率确定最佳冻存液配方。结果表明:第4次消化后就基本消化到瘤胃组织的棘层,此时即可开始收集细胞;第7次消化完后瘤胃上皮的基底层细胞基本被消化掉,此时即可终止消化细胞。经纯化后传代的细胞呈现均一的"铺路石"形态,生长曲线明显呈"S"形,且经CK-18免疫荧光染色后鉴定为阳性,同时PCR检测到上皮细胞特异性标志蛋白E-钙黏蛋白和碱性磷酸酶均有表达。此外,ORECs经不同体积配方冻存液冻存复苏后发现,冻存液配方为V_(FBS)∶V_(DMEM)∶V_(DMSO)=9∶0∶1时ORECs的细胞活力及贴壁率最高,且传代后的细胞生长状况良好。因此本试验成功建立了ORECs的体外分离培养、冻存和复苏方法。     

紫外线诱变传代对致病性沙门氏菌的影响

本研究通过对致病性沙门氏菌SW1和SW4紫外线诱变传代,观察其血清型、致病力及质粒图谱的变化.选择紫外线诱变沙门氏菌SW1和SW4菌株6min后培养,每个菌株随机挑取9个单菌落连续传60代后做其质粒图谱分析、毒力以及血清型检测.结果表明经紫外线诱变连续传60代后,沙门氏菌SW1的部分单菌落血清型发生明显变化,质粒图谱及毒力无明显变化;而沙门氏菌SW4的血清型和质粒图谱无变化,但单菌落SW4-60-6变为无毒力菌株,这表明病原菌的血清型和致病力在外界条件的作用下会发生一定的改变.     

鲤鱼尾鳍细胞的体外培养及其生长状态的研究

采用组织块培养法，对鲤鱼尾鳍组织进行培养，在28℃温度下，用添加20％胎牛血清的M199培养基进行培养，在此过程中，对培养的细胞进行观察及研究，描述了细胞形态及其它相关细胞生物学特征。     

鸡胚盲肠上皮细胞的传代培养

本研究旨在探讨鸡胚盲肠上皮细胞传代培养条件及其特性,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型。分别用胰酶-EDTA联合消化和分步消化2种方法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定贴壁细胞覆盖率选择细胞传代的适宜消化方式;筛选了传代细胞培养液中L-GLN和胰岛素的最佳浓度,通过贴壁差进一步纯化盲肠上皮细胞,探索其合适的培养条件。通过形态学观察、透射电镜、免疫组织化学技术、组织化学技术、糖原染色、流式细胞术的方法对传代细胞特性进行了鉴定。结果表明:胰酶-EDTA联合消化、15min贴壁差纯化除去成纤维细胞,72.5mg.L-1 L-GLN、0.05mg.L-1胰岛素和5%FBS的传代细胞培养液更有利于盲肠上皮细胞的生长;经形态学和透射电镜观察,AKP、Vimentin及PAS染色,所培养的传代细胞具有典型的上皮细胞特征,在传代后24～72h盲肠上皮细胞纯度达95%以上,贴壁细胞覆盖率达85%以上;细胞凋亡测定表明,细胞连传5代,活性较好,第6代细胞凋亡率显著增加,贴壁细胞覆盖率降低。本研究提示用该法传代可获得稳定、数量大、活性高、纯度高的鸡胚盲肠上皮细胞。     

广西巴马小型猪供核细胞的传代培养和冷冻保存及肌肉成纤维细胞HDAC1基因的mRNA的表达

本试验旨在建立猪颗粒细胞、胎儿成纤维细胞和新生巴马小型猪不同组织来源成纤维细胞的分离及传代培养技术体系和冷冻保存方法,并比较猪卵丘/颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDAC1基因的mRNA表达的差异,从分子水平上鉴定新生巴马小型猪肌肉成纤维作为供体细胞的可行性。运用组织块贴壁培养方法分离不同来源的组织细胞进行培养,并比较了常规冷冻保存和微量冷冻保存对细胞复苏率的影响,同时,运用实时定量PCR的方法检测猪卵丘/颗粒细胞和新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDAC1基因mRNA表达的动态变化。研究结果表明：（1）猪颗粒细胞单层细胞的生长需要5～6d;用组织块法获得猪胎儿成纤维细胞单层的生长时间为10～11d;用组织块法可以成功地对新生巴马小型猪的肌肉、肺、肾脏、心、睾丸组织的成纤维细胞进行分离和传代培养,肾和睾丸组织的成纤维细胞贴壁生长后,长满形成单层细胞需要12～13d,而肺、肌肉和心脏组织的则需要15～16d。（2）细胞的微量冷冻保存效果优于常规冷冻保存（P〈0.05）。（3）猪卵丘/颗粒细胞与新生巴马小型猪肌肉成纤维细胞HDACl mRNA的相对表达量为1.000比0.985,两者差异不显著（P〉0.05）。新生广西巴马小型猪不同组织来源的成纤维细胞的分离及传代培养和微量冷冻法,丰富了这种猪体细胞的分离培养种类,为其体细胞核移植研究提供了丰富的供体细胞,并从表观遗传的角度分析,鉴定了新生巴马小型猪胎儿成纤维细胞与猪卵丘/颗粒细胞一样适合作供体,为核移植前的供体细胞鉴定提供了新的方法。     

嘧肽霉素高产菌株的选育

以不吸水链霉菌辽宁变种为出发菌株,经紫外线、亚硝酸诱变和紫外线与嘧肽霉素复合诱变,选育出了嘧肽霉素的高产菌株,抑菌圈直径由原来的20.5mm提高到36.4mm。传代培养5代表明,该高产菌株遗传特性稳定。     

鸡精原干细胞的体外培养

本试验旨在探索不同基础培养基对鸡精原干细胞（spermatogonial stem cells,SSCs）体外培养的影响,以期选出最佳的培养体系,并用其进行传代培养,以观察精原干细胞继代培养的特性。结果表明：在高糖DMEM培养体系和TCM199培养体系中,SSCs均能正常生长和增殖,在以DMEM和TC199为基础培养基的培养体系中,在SSCs的活率、克隆形成率上显著不差异,但SSCs在以DMEM为基础培养基的培养体系中生长情况较好,为最佳培养体系。在RPMI1640培养体系中,SSCs克隆形成率、活率较低,比前2种培养体系的效果差异显著。在添加细胞因子的培养基中精原干细胞在体外传至第3代。     

福寿螺足组织和外套膜组织细胞培养的初步研究

采用改良的M199培养基,对福寿螺(Ampullaria gigas Spix)足组织和外套膜组织细胞进行了体外培养研究。结果显示:接种6 h后,细胞开始从组织块中迁出,培养至第3天,迁出细胞在组织块周围形成生长晕,第21~28天,细胞覆盖大部分培养瓶底壁。足组织和外套膜组织细胞分别被传至8代和9代。足组织和外套膜组织细胞在原代培养物中主要有两类,一为上皮样小细胞,形态为圆形、椭圆形或多边形,直径7~15μm;另一类为上皮样中型和大型细胞,形态椭圆形或多边形,直径15~30μm。上皮样小细胞数量多,增殖速度较快,在原代和传代培养的中后期皆可形成细胞单层。外套膜组织细胞的生长和增殖能力高于足组织细胞,其贴壁性也好于足组织细胞,Hoechst荧光染色显示外套膜组织细胞的细胞凋亡指数明显低于足组织细胞。结果表明,贝类外套膜组织有潜力成为建立连续细胞系的组织来源。