猪卵母细胞去核方法的改进

对猪体细胞克隆技术中关键步骤之一的去核方法作了较深入的研究。结果表明，由本实验室改进的Willadsen去核法——二步挤压去核法，无论在去核操作成功率（73．9％）上还是在去核效率（81．2％）上都明显好于McGrath-Solter去核法（42．5％、67．4％，P〈0．05）；同时，本试验还发现，卵母细胞成熟培养36h后去核组去核效率（89．1％）显著地高于成熟培养44h后去核组（55．8％，P〈0．05），而核移植重构胚的发育率2个组间无显著差异。     

荧光定量PCR检测小鼠卵母细胞中Mad2 mRNA的表达

目的:应用SYBR G reen I染料法建立检测Mad2 mRNA表达的实时荧光定量PCR的方法,并探讨小鼠卵母细胞减数分裂成熟中Mad2 mRNA的表达。方法:采用实时荧光定量PCR的方法,以SYBR G reen I为荧光染料,梯度稀释的重组质粒为模板制作标准曲线,并以此方法分析了小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Mad2 mRNA表达的动态变化。结果:建立了实时荧光定量检测方法分析小鼠卵母细胞中Mad2 mRNA的表达,该方法灵敏、特异,扩增效率接近100%。进行了标准曲线的制作,以及对目的基因Mad2转录水平的绝对定量。结论:实时荧光定量PCR是检测基因表达水平的理想选择,在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中Mad2 mRNA表达存在动态变化。     

卵母细胞激活的信号机制

本文主要阐述精子与卵母细胞质膜相互作用的信号转变,特别是精子启动这些信号途径的机制,并讨论与精子诱导的Ca2 振荡发生反应并在卵母细胞激活中起重要作用的下游信号分子。     

序贯培养法对猪孤雌激活胚胎发育能力的影响

经体外成熟、孤雌激活和培养获得猪胚胎,研究了不同培养体系、共培养体细胞和序贯培养对猪孤雌激活胚胎发育的影响。试验表明:孤雌激活卵母细胞在SOF 10?S培养体系中分裂效果最好,添加胎牛血清的NCSU-23和颗粒细胞对胚胎发育有促进作用,培养6d后发育到桑囊胚的比率增加(P<0.05)。在序贯培养的前3d,SOF培养基(不含葡萄糖)和颗粒细胞对胚胎的发育有促进作用,分裂率(P<0.05)和突破4细胞阻滞的数目显著增加,在培养的后3d,添加胎牛血清的NCSU-23和输卵管上皮细胞能支持较多胚胎发育到桑囊胚,桑囊胚的发育率为(59.5±3.2)%(P<0.05)。结果表明,SOF培养基和颗粒细胞 添加胎牛血清的NCSU-23和输卵管上皮细胞的序贯培养系统能较好的促进胚胎的发育。     

牛卵泡卵母细胞的体外成熟和冷冻保存

在简化牛卵母细胞体外成熟的基础上,观察了保护剂、平衡温度、预平衡方法、解冻方法以及冷冻方法对牛卵泡卵母细胞冷冻的影响。结果表明:在体外成熟培养液中添加26.2 mmol/L的NaHCO3和对屠宰场卵巢进行选择更能促进牛卵母细胞的体外成熟;无论是程序冷冻还是玻璃化冷冻,乙二醇(EG)与甘油(GLY)相比更能促进牛卵泡卵母细胞的冷冻效果;在程序冷冻中,冷冻液中添加0.1 mol/L蔗糖比添加0.3mol/L的蔗糖更能促进牛卵泡卵母细胞的冷冻;在玻璃化冷冻中,37℃和25℃的平衡温度比4℃更适合牛卵泡卵母细胞的冷冻;在10%、5%、1%的预平衡浓度之间,5%的预平衡浓度即可达到预平衡的效果;在解冻时,多步脱除保护剂更能保护冷冻的卵母细胞;比较了几种最小样本量(minimum size sample,MSS)玻璃化冷冻方法,解冻成熟培养后的成熟率,拉细毛细玻璃管冷冻法为(41.67±3.19)%,极显著高于未拉细毛细玻璃管冷冻法(glassmicropipette,GMP)的(30.19±1.93)%和固体表面冷冻法(solid surface vitrification,SSV)的(28.33±2.89)%(P<0.01)。     

冷冻方法和冷冻保护液对山羊卵母细胞发育的影响

比较了不同冷冻方法和冷冻保护液对山羊卵母细胞冷冻-解冻后体外受精和激活后的发育效果.结果表明,开放式拉长塑料细管(OPS)法的效果好于玻璃化细管法和常规冷冻法;在OPS法中,20%EG 20%DMSO对卵母细胞的冷冻保护效果好于EDFS40,而在玻璃化细管法冷冻中,则是EDFS40好于20%EG 20%DMSO.对于常规冷冻法而言,则是1.5mol/L EG的冷冻效果好于1.5mol/L PROH.     

猪卵母细胞的体外成熟影响因素的研究

本试验研究了猪卵母细胞的体外成熟体系，着重研究了季节因素、FCS、pFF、胰岛素和17β-E₂对猪卵母细胞体外成熟的影响。结果表明：①3月~4月和10月~11月卵母细胞成熟率最高，与其它月份相比差异显著（P<0.05）；②卵泡期卵母细胞成熟率和卵裂率均显著高于黄体期；③添加10%FCS、10% pFF、20% FCS和10% FCS+10% pFF的卵裂率差异不显著（P>0.05），添加10% FCS或10% pFF的成熟率差异不显著，与添加20% FCS或10% FCS+10% pFF成熟率差异显著；④培养液中添加一定量的胰岛素和17β-E₂有助于提高成熟率和卵裂率。     

EGF和IGF-1对水牛卵母细胞体外成熟培养的影响

作者研究了在培养液中添加不同浓度的EGF、IGF-1以及EGF联合IGF-1对水牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明：①添加各种浓度的EGF都可以提高水牛卵母细胞的成熟率，其中50 ng/ml EGF有显著影响(P＜0.05)。②10、20 ng/ml的IGF 1对水牛卵母细胞体外成熟无显著影响(P＞0.05)； 30 ng/ml的IGF-1能显著提高水牛卵母细胞体外成熟率(P＜0.05)。③添加20 ng/ml EGF+30 ng/ml IGF-1组卵母细胞体外成熟率高于添加30 ng/ml的IGF-1组，显著高于添加20 ng/ml EGF组和对照组(P＜0.05)。可见，EGF和IGF-1对水牛卵母细胞体外成熟有协同作用。     

猪MII期卵母细胞的玻璃化冷冻的初步研究

试验采用3种冷冻载体(麦管、开放式拉长麦管和半麦管)对猪卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的影响进行研究,以探讨采用自制半麦管作为载体对猪MII期卵母细胞玻璃化冷冻后发育能力的影响.结果发现,采用半麦管法、OPS法玻璃化冷冻的猪卵母细胞的形态完整率、存活率、卵裂率分别为90.85%、60.07%、20.43%和84.15%、55.71%、14.71%,无显著差异(P＞0.05),但采用半麦管法的结果好于OPS法;与麦管法的形态完整率、存活率和卵裂率(分别为60.06%,39.64%和0)均有显著性差异(＜0.05).结论为采用半麦管法玻璃化冷冻猪卵母细胞可以稍微提高其冻后发育能力.     

不同采卵方法及卵巢所处性周期阶段对绵羊卵母细胞体外成熟的影响

本试验主要从采集方法和性周期阶段2方面对绵羊卵母细胞体外成熟的影响进行了探讨。结果表明：不同采卵方法的采卵效果存在差异，卵裂率切割法显著高于抽吸法(27.9%，49.5%；P<0.05)；A、B级卵母细胞成熟率极显著高于C级(75.3%，64.4%，29.1%，P<0.01)，卵裂率A、B级均显著高于C级(42.5%，35.8%，16.0%，P<0.05)；从卵泡期和黄体期卵巢采集到的卵母细胞的体外成熟率和卵裂率分别为66.7%、62.9%；38.2%、34.4%，没有显著差异 (P>0.05)。