猪水泡病病毒RT-PCR检测方法的建立

根据基因库中的猪水泡病病毒(SVDV)高度保守的VP1基因的序列,设计了与SVDV互补的2对特异性引物,通过对影响PCR扩增因素的筛选,成功地扩增出251bp和366bp特异性条带,将其克隆入pMD18-T载体中,并进行序列测定,与已发表的SVDV基因比较发现,核苷酸的同源性为100%,证实为SVDV的VP1段基因。通过检测FMDV、VSV、BHK21细胞等,对照的扩增结果均为阴性,验证其特异。对SVDVRNA进行10倍系列稀释后检测,结果SVDVRNA在10-4稀释度时仍能检测到阳性,说明具有较好的敏感性。此项试验能稳定、高效、快速地检测出猪水泡病病毒。     

半定量RT-PCR法分析猪肝脏中铜锌超氧化物歧化酶mRNA表达水平

细胞内铜锌超氧化物歧化酶（CuZnSOD）是动物体内一种重要的抗氧化酶。本实验室构建了优化的半定量RT-PCR法，以18S rRNA为内标，研究猪肝脏组织中CuZnSOD基因mRNA表达水平。提取猪肝脏组织总RNA，经反转录后进行扩增，先寻求PCR线性扩增范围，确定RT．PCR的最佳循环数和Mg^2＋浓度。扩增后用VDS摄像系统扫描PCR扩增产物的电泳条带灰度。通过CuZnSOD PCR产物的灰度与18S rRNA PCR产物的灰度之比，即可计算出CuZnSOD mRNA的相对含量。     

应用竞争PCR检测丙酸盐对体外培养牛肝细胞丙酮酸羧化酶mRNA水平的影响

根据牛肝细胞内PC(丙酮酸羧化酶)基因组与PCcDNA相比多含有一个内含子序列．在其中再插入一外源DNA序列．从而使最终构建的突变体片段的长度大于PCcDNA的长度，成功构建了PCcDNA的竞争DNA模板，然后应用竞争PCR方法研究了丙酸盐对体外培养新生牛单层肝细胞PCmRNA水平的影响。使单层肝细胞培养液中丙酸钠浓度分别为0、1．5、2．5、3．5、4．5、8．5、11．5mmol／L，处理24h，提取总RNA、逆转录，在同一体系中用相同引物扩增目的带和竞争模板带。结果表明．随着丙酸钠浓度的升高．PCmRNA水平呈上升趋势，提示肝细胞内PCmRNA的表达水平受培养液中丙酸钠浓度的影响。     

RT-PCR法快速鉴别新城疫强弱毒株的试验

通过对大量不同毒力NDV F基因核苷酸序列的分析，根据强弱毒株F0裂解位点的序列差异设计合成了三对引物，建立了快速诊断新城疫并能鉴别其强弱毒株的反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法，整个试验过程可在5h内完成。试验表明，该方法具有快速特异和操作简便的特点，不仅适用于对鸡胚毒的检测，而且适用于对病鸡组织匀浆液的检测，是新城疫鉴别诊断和流行病学调查的颇具潜力的分子诊断方法。     

一株基因Ⅶ型新城疫病毒的分离及分子鉴定

从一起新城疫暴发的病例中分离出1株新城疫病毒（NDV），命名为铜山分离株（TS）。运用RT-PCR技术，克隆了该分离株F基因的重要功能片段（约0.5kb)，并进行了序列测定。序列分析表明，TS分离株在F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为^112-R-R-Q-K-R-F^117，与NDV强毒株特征相符，且具有101外的K（赖氨酸）和121处V（缬氨酸）2个特征性氨基酸，与基因Ⅶ型NDV的特性完全相符。     

Sequential expression of myogenic regulatory factors in bovine skeletal muscle and the satellite cell culture

Myogenic regulatory factors (MRFs) are important in the control of skeletal muscle development. To understand myogenic regulation by MRFs in bovine adult muscle cells, their expressions, namely that of Myf5, MyoD, myogenin, and MRF4 in the biceps femoris muscle (BF) and in the satellite cell culture, were analyzed by RT-PCR. In the BF, all four MRFs were expressed and in particular, myogenin and MRF4 were strongly expressed, whereas Myf5 was faintly expressed. The satellite cells prepared from the BF expressed Myf5, but only a trace of MyoD, at day 9 of culture. During the growth of the cells to day 14, the MyoD and myogenin expressions gradually increased, and that of MyoD expression reached its maximum at the confluence of the culture. After induction of myogenic differentiation by a serum-free medium at day 14, Myf5 expression gradually decreased, and the up-regulated expression of MyoD was suppressed, whereas myogenin expression continued to increase sharply. Following the myogenin expression, MRF4 also drastically increased toward the myotube formation of the cells. When huge myotubes were formed at day 18, Myf5 was expressed at a low level, whereas the MyoD expression remained at a moderate level.     

RT-PCR快速检测口蹄疫病毒

根据口蹄疫病毒VP1基因的序列，设计了1对引物，建立了检测口蹄疫病毒的RT－PCR方法。对FMDV各毒株检测，结果均为阳性，而对猪病毒性疾病相关病毒进行检测，结果均为阴性；检测19份已知阳性样品，检出率100％；与动物接种试验比较，符合率100％，证明该方法特异，与经典方法动物接种试验比较，其灵敏度提高100倍左右；对O3I3株的细胞毒进行检测，其敏感度达10个TCID50。初步结果表明所建立的RT－PCR技术可用于口蹄疫的诊断和流行病学调查。     

大豆吡哆醇生物合成蛋白基因(PDX)的电子克隆和进化分析

电子克隆(In silicocloning)是随着基因组计划和EST计划实施而发展起来的利用生物信息学手段进行基因克隆的新方法。根据物种间同源基因相对保守的特点,以拟南芥(Arabidopsis thaliana)吡哆醇生物合成蛋白cDNA序列为信息探针,对大豆(Glycine max)EST数据库进行同源搜索和序列拼接,获得了1 280 bp长的大豆吡哆醇生物合成蛋白的基因序列(GenBank登陆号为DQ139265)。经过RT-PCR扩增、基因组PCR扩增、分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆序列完全一致。该基因具有完整的开放阅读框架(ORF,20~955 bp),编码311个氨基酸。通过与水稻、日本百脉根、烟草、截形苜蓿等物种的吡哆醇生物合成蛋白序列比对,发现该基因具有高度的保守性。表明根据物种间同源基因序列,对跨物种间EST数据库进行同源检索、筛选、拼接,是克隆基因的有效途径。     

棉纤维发育相关基因时空表达与纤维品质的关联分析

以14个纤维品质差异的棉花品种(或品系)为材料,研究10个纤维发育相关基因时空表达变化与纤维品质的关系,为阐明棉纤维发育相关基因与纤维品质形成关系提供理论基础。利用实时荧光定量PCR技术检测10个基因在14个供试品种(或品系)不同纤维发育时期的相对表达量,结果表明,虽然遗传背景完全不同,但它们具有某些共同表达特征。GhExp1、GhCIPK1、GhSus1、GhSusA1和GhPL这5个基因都是在纤维伸长期优势表达;GhACT1、GhRacA和GhRacB是在纤维伸长前期和次生壁加厚期高表达;而GhCelA1和GhcelA3是在纤维伸长后期和次生壁加厚期优势表达。这些基因表达谱与纤维品质关联分析显示,GhRacA在23DPA高表达且表达量与纤维品质显著正相关,其余基因在低表达时其表达量与纤维品质呈显著性相关,而在高表达时其表达量与纤维品质无相关性。GhExp1在20DPA的表达量与纤维比强度和整齐度呈显著负相关,与伸长率呈极显著正相关;GhPL在23DPA的表达量与纤维长度呈显著负相关;GhRacA在5DPA和23DPA的表达量均与伸长率呈极显著正相关;GhRacB在10DPA的表达量与长度和整齐度呈显著负相关;GhCelA1基因在5DPA的表达量与纤维长度呈显著正相关,与马克隆值呈显著负相关,在10DPA的表达量与马克隆值呈显著正相关,与伸长率达到极显著正相关,与比强度呈显著负相关,与长度和整齐度呈极显著负相关;GhCIPK1、GhACT1、GhSus1、GhSusA1和GhCelA3 这5个基因在纤维发育各时期的表达量与纤维品质各指标未检测到相关性。