鲟鱼肝病组织病理研究进展

正近些年随着鲟鱼人工养殖业在国内的迅速发展,我国已经成为世界上最大的鲟鱼养殖国,鲟鱼养殖产量占世界鲟鱼养殖总产量的80%以上。大规模、高密度、工厂化的养殖模式导致疾病的频繁暴发和蔓延,严重制约了鲟鱼养殖业的健康发展。养殖环境的污染、苗种及饲料厂商的参差不齐等因素都为鲟鱼肝脏疾病的暴发埋下了隐患,关于鲟鱼疾病的研究得到了业内广泛重视,其中关于肝脏疾病的研究已成为重点。一、鲟鱼肝脏疾病的临床症状鲟鱼患肝脏疾病的前期体表及临床解剖观察没有     

七彩神仙鱼 BTN1A1 基因克隆及其在嗜水气单胞菌胁迫下的表达分析

【目的】克隆七彩神仙鱼（Symphysodon aequifasciatus）嗜乳脂蛋白 1A1（Butyrophilin 1A1, BTN1A1）基因,分析其在病原刺激下的表达模式,为了解七彩神仙鱼 BTN1A1 基因功能提供依据。【方法】利用生物信息学对七彩神仙鱼 2 个 BTN1A1 基因（BTN1A1-1 和 BTN1A1-2）进行结构和进化分析。根据前期获得的七彩神仙鱼皮肤转录组数据,选取 BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 基因的 CDS 区设计引物进行克隆。采用 qRT-PCR 分析 BTN1A1 在各组织中的表达及嗜水气单胞菌刺激下的表达模式。【结果】BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 的 ORF 序列长度为 894、1 275 bp,分别编码 298、424 个氨基酸。BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 蛋白均具有 1 个信号肽、1 个 Ig 结构域、1 个 lg_like 结构域和 1个跨膜结构域的经典结构,BTN1A1-2 还具有 1 个胞质结构域。七彩神仙鱼 BTN1A1-1 与慈鲷科其他鱼类相似性较高,与尼加拉瓜湖始丽鱼（Archocentrus centrarchus）BTNIAI 对应氨基酸序列同源性最高、为 94.14%。但 BTN1A1-2 与其他鱼类发生分离,形成独特分支。BTN1A1-1 和 BTN1A1-2 在七彩神仙鱼各组织中均有表达,但在鳃、肠道、皮肤等与免疫相关的组织中表达量相对较高。七彩神仙鱼 BTN1A1-1 在嗜水气单胞菌胁迫后表达量先显著下降后上升,而 BTN1A1-2 表达量则先显著上升后下降。【结论】七彩神仙鱼 BTN1A1-1 基因相对保守,而 BTN1A1-2 基因在进化上较为特殊。二者在免疫刺激下的差异表达暗示其可能在七彩神仙鱼免疫防御中发生功能分化。     

斑马鱼幼鱼嗜中性粒细胞对副溶血弧菌清除的动态变化

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是人-兽-鱼共患的致病菌,严重威胁食品安全和人类的健康。为了研究宿主嗜中性粒细胞清除细菌感染的动态变化过程,利用红色荧光蛋白标记的副溶血弧菌Vp57~(RFP)菌株感染受精后48 h(hours post fertilization,hpf)的斑马鱼(Danio rerio)幼鱼耳泡,建立局部感染模型,并以大肠杆菌(Escherichia coli)Ec01菌株为对照,系统比较了副溶血弧菌和大肠杆菌的半数致死剂量(median lethal dose,LD_(50))、存活曲线以及和嗜中性粒细胞相互作用的动态过程,RT-qPCR验证炎症相关基因il1b和il10在感染前后的表达量变化。结果显示副溶血弧菌和大肠杆菌感染斑马鱼幼鱼的LD_(50)分别为7.90×10~8 CFU/mL和1.14×10~(11) CFU/mL,与感染大肠杆菌相比,斑马鱼感染副溶血弧菌后招募嗜中性粒细胞的速度更快,且数量更多。RT-qPCR结果发现斑马鱼感染副溶血弧菌后在相同时间点能够激活更高的il1b和il10基因的表达,引起强烈的炎症反应。基于以上研究,我们建立的副溶血弧菌-斑马鱼幼鱼耳泡局部感染模型,为进一步研究嗜中性粒细胞清除副溶血弧菌感染的动态过程,以及深入揭示天然免疫应答机制提供了依据。     

外源人绒毛膜促性腺激素诱导黑边石斑鱼排卵的研究

【目的】了解外源人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,HCG)诱导黑边石斑鱼(Epinephelus fasciatus)排卵的影响。【方法】以成熟的黑边石斑鱼为研究对象,测量其体长、体质量和肥满度后,在2018年7—8月,使用HCG激素(剂量为200 IU/kg或500 IU/kg)注射分别对6尾雌鱼进行成熟诱导。【结果】在200 IU/kg HCG处理中,注射24 h前有5尾雌鱼的卵母细胞处于第三次卵黄球前期阶段;注射48 h后2尾雌鱼出现核移动卵母细胞,1尾雌鱼的卵母细胞为第三次卵黄球后期阶段;注射60 h后1尾雌鱼出现排卵现象,其余5尾雌鱼均为第三次卵黄球后期阶段。在200 IU/kg HCG处理的排卵个体中,注射时其卵母细胞直径为477.0 μm,注射后60 h卵母细胞的直径增加至624.4 μm。此外,经催产、排卵、受精和孵化后共获得总卵数16 906粒,受精率为68.7%,孵化率为43.0%。而500 IU/kg HCG处理的黑边石斑鱼排卵失败。【结论】使用剂量为200 IU/kg的外源HCG激素可诱导黑边石斑鱼成熟且排卵,但为了提高排卵率、受精率和孵化率,其注射剂量和效应时间还需要进一步调节。     

黑边石斑鱼体长、年龄与性成熟、性逆转的关系研究

为调查日本长崎市沿岸海域黑边石斑鱼(Epinephelus fasciatus)体长、年龄与性成熟、性逆转之间的联系,于2015年7月至2018年6月,逐月对随机捕获的黑边石斑鱼,测定其体长、体质量、年龄、性别、性腺发育成熟度和性腺指数(GSI),并分析其血清中雌二醇(17β-Estradiol,E2)含量的变化.结果...     

低温胁迫诱导斑马鱼ZF4细胞ROS及MAPK相关蛋白表达的影响

为了研究鱼类低温下分子调控机制及其与活性氧(reactive oxygen species,ROS)之间的关系,本实验对斑马鱼(Danio rerio)胚胎成纤维ZF4细胞进行不同程度的低温胁迫(18℃和10℃),监测其在不同低温胁迫时间下(1 d、3 d和5 d)ROS的变化以及丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中蛋白的表达情况。结果显示:(1)DCFH-DA探针法表明在低温胁迫作用下,细胞内ROS含量增加。细胞内ROS上升水平与外界胁迫压力成正相关。低温处理3 d后,18℃和10℃的细胞,其ROS含量与对照组(28℃)相比分别显著升高到(1.23±0.04)倍(P0.05)和(2.31±0.08)倍(P0.05)。(2)Western Blot检测磷酸化的p38(p-p38)和磷酸化的JNK(p-JNK p54和p-JNK p46)的水平变化,结果显示低温胁迫可以使p38和JNK的活性增强,且均在10℃处理3 d达到最高水平。(3)进一步检测DNA断裂标记蛋白γH2A.X的表达水平,结果显示,无论在18℃还是10℃,其在第3天呈现高表达。本实验初步证实低温胁迫能够诱导斑马鱼细胞ROS的产生;通过对不同时间点的蛋白表达水平检测,发现p-JNK、p-p38和γH2A.X激活时间点与低温诱导ROS表达时间点相吻合。该研究为后期对斑马鱼细胞低温胁迫实验奠定基础,其中低温下处理3 d可以作为一个检测各个蛋白变化的关键时间点。     

池塘养殖和野生长江水系中华绒螯蟹扣蟹形态学及生化组成的比较研究

采用形态学测量和生化分析等方法,比较了野生和池塘养殖条件下长江水系中华绒螯蟹扣蟹的形态学、肝胰腺指数(HSI)、常规生化组成和脂肪酸组成。结果发现:野生和池塘养殖扣蟹的形态学特征差异较大,雌雄个体均有4个贡献较大的主成分(PC1,PC2,PC3,PC4),其中PC1的贡献率均远高于其他主成分,两者PC1分别由16和19个主要影响变量构成;所测36个形态学指标中,两群体雄蟹和雌蟹分别有25和22个形态学指标差异显著,进一步筛选判别贡献率较大的4~5个指标分别建立判断方程,综合判别准确率达95%以上;野生扣蟹的HSI、组织中总脂、躯体肌肉的16:0、18:1n9和20:4n6含量均高于池塘养殖扣蟹,后者组织中水分含量、躯体肌肉中的18:0、20:5n3和22:6n3高于前者。研究表明,野生和池塘养殖扣蟹的形态学和生化组成均存在较大差异,可以根据两群体扣蟹的形态学差异和判别方程鉴别两种扣蟹蟹种。     

斑马鱼早期胚胎发育囊胚sphere时期的蛋白组学研究

斑马鱼(Danio rerio)早期胚胎发育囊胚时期是胚胎发育过程的关键时期,利用i TRAQ蛋白质质谱分析技术,检测斑马鱼早期胚胎发育过程中囊胚sphere时期的蛋白质表达情况,并分析该时期表达的蛋白质的相应功能和参与调控的生物过程。以野生型斑马鱼发育至sphere时期即4 hpf的胚胎为样本,利用i TRAQ标记与LC-MS/MS串联质谱技术,结合数据库比对,对该时期表达的蛋白质进行定性和定量的鉴定分析。检测结果共鉴定到的总蛋白数为1 178个,利用生物信息学进行功能分析,发现这些蛋白广泛参与了细胞信号传递、细胞运动和细胞骨架构建、细胞增殖、细胞分化、物质合成与代谢等各项重要的生命活动过程。研究表明,利用i TRAQ标记的方法可以对4hpf时期的斑马鱼胚胎中的蛋白质进行有效的分离和鉴定,并初步建立了斑马鱼早期发育关键阶段sphere时期的蛋白质组表达图谱,以期为斑马鱼胚胎发育过程中蛋白质组学和调控机制的研究提供参考。     

低频声波频率下瘤背石磺CaM-like、CaMKII基因的表达及功能

长期栖息于潮间带的动物能够感知当地的潮汐规律,形成潮汐记忆的能力。本研究以栖息于潮间带的瘤背石磺(Onchidium reevesii)为对象,研究其通过感知潮汐来临时产生的低频声音来调节其行为与潮汐节律相协调的分子机制。通过RACE-PCR技术克隆到CaM-like基因的cDNA序列,并进行生物信息学分析和qRT-PCR实验。结果显示,瘤背石磺CaM-like基因的cDNA全长2321 bp,包括5′非编码区(UTR)366 bp,3′非编码区(UTR)1337 bp,618 bp的开放阅读框编码206个氨基酸;预测该基因编码的多肽链的原子数量是3165,分子量约为23029.64 kD,理论等电点4.64,分子式是C_(1018)H_(1544)N_(274)O_(320)S_9。N端信号肽由29个氨基酸组成。氨基酸序列比对构建系统进化树,结果显示瘤背石磺CaM-like基因与静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)、光滑双脐螺(Biomphalaria glabrata)的CaM-like基因的亲缘关系最接近,这与传统形态学分类相吻合。在实验室内模拟潮汐中低频声音刺激瘤背石磺,应用qRT-PCR检测CaM-like基因在不同组织的分布情况,结果显示CaM-like mRNA在瘤背石磺不同组织均有表达,但神经节部位的表达量显著高于背部皮肤、腹足、肠、肝胰腺、口器和蛋白腺等组织(P0.05),推测其可能参与神经系统的可塑性调节。荧光定量结果显示CaM-like、CaMKII基因分别在25 Hz和50 Hz低频声波下刺激12.4 h表达量较高,初步推测其能感知25～50 Hz声波频率。这可能与栖息于潮间带中的瘤背石磺长期感知12.4 h半日潮潮汐周期节律,形成潮汐记忆有关。本研究将为进一步深入了解瘤背石磺感知潮汐节律的分子机制奠定基础,也为探究海洋动物由海洋向陆地进化过程中对环境的适应机制提供依据。