两种提取细胞外泌体方法的比较

近期研究发现外泌体在很多生理病理过程中起着重要作用,因而外泌体已成为当前的科研热点。本研究从外泌体形态、标志蛋白的表达方面比较了He La细胞外泌体的两种常用提取方法,以期获得更有效地提取Hela细胞中的外泌体方法。利用电镜观察两种方法提取的外泌体形态;动态光散射(dynamic light scattering,DLS)测定外泌体颗粒大小及分布,蛋白印迹法(Western Blot,WB)检测外泌体标志蛋白CD63、CD81的表达。结果显示,差速离心法与PEG沉淀法所提外泌体都呈茶托样双层膜结构,直径约30~150 nm,无明显形态差异,外泌体标志蛋白正常表达,但PEG沉淀法要引入PEG,有可能影响外泌体生物活性,可见,差速离心法是一种更可靠的有效提取外泌体的方法。     

应用CRISPR/Cas9敲除HeLa细胞DDX21基因对新城疫病毒复制的影响

解旋酶家族是一类对所有生物都至关重要的酶,主要功能是基因解旋,DEAD/H-box家族RNA解旋酶是一类重要的解旋酶。DEAD-box RNA解旋酶DDX21被证实可能调控宿主细胞先天性免疫。新城疫病毒(NDV)是一种对养禽业危害严重的病原,NDV能够通过多种手段调控宿主先天性免疫,为了探讨DDX21如何调控NDV复制,本研究应用CRISPR/Cas9系统建立DDX21基因敲除的HeLa细胞系,并验证其对NDV复制的影响。针对DDX21基因共设计6条sgRNA,构建敲除载体并电转染细胞,通过药物筛选、亚克隆筛选后,以PCR和Western blot进行敲除效率的双重鉴定,并比较野生型和DDX21敲除细胞中NDV的复制效率。结果显示,由于DDX21对细胞生长至关重要,因此仅获得一株DDX21杂合子敲除细胞,Western blot结果显示DDX21表达量被显著抑制,NDV对在敲除细胞上的复制滴度明显低于野生型细胞,说明DDX21发挥正调控NDV复制的作用,本试验为DDX21调控抗病毒先天性免疫研究奠定了基础。     

湖南省珍稀雉类组织滴虫核糖体18S rRNA系统进化分析

为分析珍稀雉类组织滴虫核糖体18S rRNA序列遗传变异情况,并利用18S rRNA序列分析组织滴虫与其他原虫的种群遗传关系,应用PCR技术扩增珍稀雉类异刺线虫体内组织滴虫核糖体18S rRNA基因序列,并进行测序与分析。结果表明:异刺线虫雄虫与异刺线虫雌虫体内均含有火鸡组织滴虫,且9个组织滴虫分离株核糖体18S rRNA序列片段大小基本一致,约为590 bp,各分离株之间核糖体18S rRNA序列同源性均高于99.4%,与Gen Bank中收录其他原虫相应序列同源性均低于66.8%;通过建立NJ系统发育树,9个组织滴虫分离株与Gen Bank收录的火鸡组织滴虫位于同一分支,得到明显的鉴定。核糖体18S rRNA序列种内相对保守,但种间差异明显,可作为火鸡组织滴虫的种间遗传变异研究的分子遗传标记。     

2012年9月澧水上游罕见秋汛致洪暴雨特征分析

利用水文、气象资料和NCEP格点资料,对2012年9月澧水上游罕见秋汛致洪暴雨过程特征作分析的同时,并展开了对澧水上游致洪暴雨特征规律的分析.结果表明,澧水上游发生致洪暴雨的面雨量临界值为121.4 mm;此次致洪暴雨过程的500 hPa环流形势为典型的“两槽一脊”型分布,中尺度影响系统为深厚的西南涡系统,西南涡前有支较强的暖湿急流为致洪暴雨提供充足水汽,水汽源地为南海、孟加拉湾,这一环流形势特点是澧水上游致洪暴雨普遍性规律特征;副高的位置与澧水上游致洪暴雨的强度和持续时间有关;低层辐合高层辐散的散度特征、中低层的正涡度特征和深厚的垂直上升运动特征为此次致洪暴雨的发生提供了动力条件,长时间＞35℃的K指数为致洪暴雨提供充足的不稳定能量.     

应用G3BP1稳转细胞系监测应激状态下的应激颗粒形成

哺乳动物细胞受到应激刺激后，会在细胞中形成致密的颗粒状结构，该结构被称为应激颗粒（stress granules，SG），其中G3BP1是应激颗粒重要的组成成分和标志蛋白。为了动态监测SG的形成情况，构建稳定表达GFP-G3BP1蛋白的HeLa细胞系。首先，扩增G3BP1基因，并将其克隆到慢病毒载体中，从而获得重组质粒Lenti-GFP-G3BP1，利用三质粒慢病毒包装系统包装为表达GFP-G3BP1蛋白的慢病毒颗粒，并感染HeLa细胞，通过嘌呤霉素初步筛选阳性细胞，随后，采用有限稀释法筛选出稳定表达GFP-G3BP1蛋白的HeLa单克隆细胞系，并采用Western blot和直接免疫荧光方法检测细胞系中GFP-G3BP1蛋白的表达及功能。结果发现，在荧光显微镜下可以观察到明显的G3BP1细胞质特异性荧光，Western blot结果显示GFP-G3BP1特异性条带，说明稳定表达GFP-G3BP1的HeLa细胞系构建成功。最后，作者利用亚砷酸钠/热休克/新城疫病毒处理细胞系后对GFP-G3BP1表达形态进行动态监测，证实了细胞受到刺激后，SG逐渐积累的过程。该细胞和相关动态监测方法为后续SG和新城疫病毒的相关研究奠定了基础。     

离心泵叶轮内部流场的数值计算

为弥补基于传统一元理论方法中流场计算的不足,该文基于流体的连续方程和运动方程,用Fortran语言编程实现了离心泵叶轮内部流场的数值计算,S1流面上采用有限单元法、S2流面上采用流线曲率法,2类流面迭代计算直至收敛得到离心泵叶轮内部流场分布。对2类相对流面方法计算得到的叶轮内部流场进行了分析。结果表明,叶轮内部相对速度分布合理,叶片头部受冲击作用,压力面和吸力面流速相差较大。叶轮内部压力分布从进口到出口逐渐增大,梯度较小,叶轮做功平稳,进口处压力从后盖板到前盖板逐渐降低。同时考虑流体的连续方程和运动方程后,对比传统一元理论方法的计算结果,计算得到的轴面速度从后盖板到前盖板间各条流线的分布规律相差较大,在叶轮进口段差别最大,具有较强的三维特征,表明本文数值计算结果可更好地反映离心泵叶轮内部的三维真实流动规律。     

水泵水轮机转轮三维反问题设计与特性研究

采用全三维反问题设计方法,按照水泵工况确定设计参数,从水轮机方向进行流场计算,完成某一中高水头水泵水轮机转轮的水力设计。针对设计开发的转轮,通过模型实验测试其在不同运行工况下的性能。结果表明,设计的水泵水轮机转轮在水泵工况下的最高机组效率达到91.34%,且机组运行平稳;水轮机工况的最高机组效率为88.5%。基于全流道粘性数值计算的转轮内部流动分析表明,水泵工况下,水流光顺地通过流道,转轮内部流动损失较小;水轮机工况下,转轮进口附近存在较严重冲击损失且叶片背面低压区面积较大,影响转轮的作功能力。     

不同NDV株V蛋白多克隆抗体的制备和初步应用

新城疫病毒(NDV)的V蛋白是一种干扰素拮抗蛋白,该蛋白表达量的差异对NDV细胞嗜性的影响是目前的热点问题.为制备NDV V蛋白多克隆抗体,本研究以Class Ⅰ NDV 9a5b株和Class Ⅱ NDV ZJl P基因为模板扩增V蛋白PNT结构域和V蛋白半胱氨酸富集区(CTD)结构域,分别克隆至pET-28a(+)载体和pCold TF载体中,获得表达V蛋白或其CTD结构域的重组表达质粒.将重组质粒转化大肠杆菌诱导表达;纯化重组蛋白,并分别免疫小鼠,制备针对Class Ⅰ和ClassⅡNDV V蛋白的多克隆抗体.利用该多克隆抗体,western blot检测NDV 9a5b、La Sota、ZJ1、Herts/33株感染HeLa和DF1细胞后V蛋白的表达量变化.结果显示制备的多克隆抗体可以用于NDV V蛋白的检测,V蛋白在易感宿主禽源细胞中的表达量明显高于哺乳动物细胞.研究表明NDVV蛋白的表达水平与宿主细胞的种属差异相关.     

两株不同宿主来源的基因VII型新城疫病毒的生物学特性比较及全基因组序列分析

为研究不同宿主来源的新城疫病毒(NDV)的生物特性及分子特征,本研究比较了两株(Ch/CH/SD/2008/128和Du/CH/SD/2009/134)同属ClassⅡ基因VII型的NDV分离株的生物学特性,并采用RT-PCR方法扩增及测定两株病毒的全基因组序列。结果显示,两株病毒对雏鸡具有相同的高致病性,但鸡源分离株Ch/CH/SD/2008/128对雏鸭致死率高达70%,而鸭源分离株Du/CH/SD/2009/134对雏鸭致死率仅为20%。全基因组序列比较分析显示:两株病毒的基因组长度均为15 192 nt,裂解位点为112RRQKQF117,属于典型的强毒特征,并且两者之间同源性超过96%。Ch/CH/SD/2008/128的F和HN蛋白中某些氨基酸位点与其他VII型病毒存在差异,这可能是导致该病毒对鸭具有高致病性的原因。结果表明两株不同宿主来源的ClassⅡ基因VII型NDV在遗传信息方面差异不大,但对鸭的致病力具有明显差异。     

家禽疫苗诱导的粘膜免疫应答

本文首先对黏膜免疫系统组成、特征和黏膜免疫应答的机理研究进展进行了论述,同时归纳比较了几种主要禽病疫苗的免疫接种途径和刺激黏膜免疫应答的相关性,为日后更好地利用黏膜免疫研制和应用家禽疫苗奠定理论基础。