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利用PCR技术扩增出2型猪圆环病毒(PCV)ORF2保守区基因107 bp片段,并克隆到pMD-19-T载体上,纯化的质粒作为PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释质粒为标准模板,进行荧光定量PCR,并绘制标准曲线。再以提取的PCV-2、PCV-1、猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病毒(PRV)的DNA作为模板,采用同样体系进行实时PCR检测。结果表明:建立的实时定量PCR方法,起始模板浓度与样本阈值循环数(Ct)值之间呈很好的线性关系,标准曲线斜率为-0.32,相关系数r2为0.997,Ct值为11.9~26.9。PCV-2能扩出S型荧光曲线,熔解曲线的峰狭窄单一,而PCV-1、PPV和PRV均不能扩出。对32份健康猪和32份断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)可疑猪样品定量检测:健康猪阳性率为44%(14/32),病毒载量均小于104拷贝.μL-1;PMWS可疑猪阳性率96.8%(31/32),病毒载量均大于105拷贝.μL-1。实时荧光定量PCR方法可用于2型猪圆环病毒定性及定量的检测。 相似文献
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参照GenBank中的猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropeumoniae,App)血清1和3型菌株序列设计了1对特异性引物,用PCR方法扩增毒素Ⅳ(ApxⅣ)基因3’端1096bp的目的片段,然后克隆到pMD 18-T载体中,转入大肠杆菌(Eschetichia coli)的宿主菌DH5a中,提取阳性克隆质粒进行双酶切和测序鉴定,将T-载体中切下目的片段定向克隆到pET32a(+)中,转入E.coli BL2I(DE3),经IPTG诱导可表达分子量约60kD的蛋白,免疫转印鉴定呈阳性,ApxⅣ基因体外成功表达。以纯化的表达产物包被ELISA板,初步检测了一些血清样品,结果预示表达的蛋白可用于区分灭活疫苗免疫和野毒感染。 相似文献
74.
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快速检测大肠杆菌O157的LAMP方法的建立与评价 总被引:1,自引:0,他引:1
利用DNA环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),以rfbE基因为靶序列,设计LAMP引物,建立LAMP反应体系与条件,进行灵敏度和特异性试验.结果显示,整个检测过程仅需1h即可通过肉眼直接目测试验结果.在灵敏度试验中,rfbE-LAMP对O157菌液和模拟阳性样品的最低检测限分别为1CFU/mL和1 CFU/g.在特异性试验中,以其他血清型大肠杆菌以及沙门杆菌基因组DNA为模板对rfbE基因进行检测,均没有发生非特异性扩增反应.试验建立的LAMP检测方法具有操作简单安全、检测灵敏度高、特异性高的特点,能够满足基层实验室、应急检测或现场监测等方面的使用需求. 相似文献
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为了建立快速检测猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropeumoniae)抗体的间接ELISA方法,将质粒pET-rApxⅡ转化至BL21,IPTG诱导表达毒素rApxⅡ融合蛋白,经亲和层析纯化后的蛋白作为检测抗原.对ELISA各检测条件进行优化,结果显示,抗原最适包被浓度为10 μg/mL,血清最佳稀释度为1:80.用建立的ELISA方法对猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、猪副嗜血杆菌、大肠杆菌阳性血清进行检测,均无交叉反应.利用建立的ELISA方法从172份临床血清样本中检测出84份阳性血清样本,而利用Cps-ELISA试剂盒检测到74份阳性样品,本方法检测总符合率达83%. 相似文献
78.
通过研究6种中药生物碱对细菌内毒素(LPS)作用下猪血管内皮细胞分泌细胞因子血栓素B2(TXB2),内皮素-1(ET-1)和E-选择素(E-selectin)的影响,拟探讨生物碱抗LPS的药理作用机制。培养猪血管内皮细胞至单层融合状态,加入LPS刺激,3 h后加入高、中、低3种浓度的6种中药生物碱青藤碱、防己诺林碱、水苏碱、川芎嗪、苦参碱和吴茱萸碱,继续培养21 h后收集细胞上清液,用ELISA测定TXB2,ET-1和E-selectin的含量。结果,水苏碱高剂量组和川芎嗪高剂量组的TXB2含量极显著低于LPS对照组,川芎嗪中剂量组和吴茱萸碱高剂量组显著低于LPS对照组;苦参碱高剂量组的ET-1含量极显著低于LPS对照组,青藤碱高剂量组显著低于LPS对照组;防己诺林碱高剂量组和吴茱萸碱中剂量组的E-selectin含量显著低于LPS对照组。结果提示六种中药生物碱具有明显的抗细菌内毒素作用,可在由TXB2,ET-1和E-selectin介导的机体凝血、休克和炎症等病理损伤过程中发挥治疗作用。 相似文献
79.
用RT-PCR方法扩增届猪传染性胃肠炎病毒S基因主要抗原位点A、D,将其亚克隆至供体质粒pFastBacl,得到重组转移质粒pFastBael-TS1,转化到Escherichia coli DH5α中,提取阳性克隆质粒再转化到含穿梭载体bacmid的E.coliDHl0Bac中,发生转座作用,经蓝白斑筛选得到重组穿梭载体Bacmid-TS1,经PCR鉴定后再转染Sf9昆虫细胞,经空斑筛选得到纯化的重组病毒rAcV-Bac-FS1,经1FA、SDS-PAGE和Western-blot鉴定,重组杆状病毒TS1蛋白(相对分子质量约43 000) 在Sf9昆虫细胞中得到表达. 相似文献
80.
白介素2基因与猪圆环病毒2型ORF_2基因真核双表达质粒的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2) 的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA) 等方法验证基因的表达情况.结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基凶的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2. 相似文献