康宁木霉固态发酵改善茶渣营养价值

本试验旨在研究康宁木霉固态发酵茶渣,提高茶渣营养价值,并筛选出最佳的发酵条件。用单因素试验优化发酵茶渣的基质比例（茶渣∶玉米粉=6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）、料液比（3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3）、接种量（2%、4%、6%、8%、10%）、发酵温度（25、28、31、34、37 ℃）和发酵时间（0、2、4、6、8、10、14、22 d）。以基质比例、发酵温度、接种量和发酵时间为影响因素,进行L9（3⁴）正交试验确定茶渣最优发酵条件。测定各组发酵产物粗蛋白质、粗脂肪、还原糖、黄酮、皂苷和咖啡因含量,计算各组合的综合评分。确定最优条件后进行对比试验,比较了发酵前后茶渣的营养成分、活性物质和游离氨基酸含量。结果表明：1）单因素试验中,以下条件的综合评分最高：基质比例为7∶3,料液比为5∶5,接种量为8%,发酵温度为31 ℃,发酵时间为6 d。2）正交试验表明,康宁木霉发酵茶渣（料液比为5∶5）的最佳条件是：基质比例为7.0∶2.5,发酵温度为31 ℃,接种量为7%,发酵时间为6或7 d。3）与未发酵茶渣相比,最优条件下发酵茶渣的粗蛋白质、还原糖、黄酮、咖啡因、多种游离氨基酸含量和必需氨基酸/总氨基酸、风味氨基酸/总氨基酸均显著提高（P<0.05）,皂苷含量显著降低（P<0.001）,粗脂肪含量与未发酵茶渣无显著差异（P>0.05）。发酵6和7 d的茶渣营养成分和活性物质含量无显著差异（P>0.05）。由此可见,康宁木霉发酵茶渣能够改善茶渣的营养价值。     

老芒麦衰老过程形态特征变化规律及对养分添加的响应

试验以青藏高原青海省高寒草地中广泛分布和退化草地补播改良中的常用牧草品种-‘青牧1号’老芒麦为研究对象,在青藏高原东北部,青海湖湖东地区设置1龄到6龄老芒麦自然生长田,6龄老芒麦施肥田和老芒麦连续施肥田（6年）的3个处理,测定老芒麦地上生物量和穗部特征并进行比较分析。结果表明：青牧1号老芒麦2龄和3龄地上生物量较高,3龄后逐年降低。青牧1号老芒麦地上生物量变化情况,可以分为4个阶段,1龄期,2~3龄期,4~5龄期和6龄期。老芒麦单穗重从2龄到5龄逐渐增加,6龄显著性降低。青牧1号老芒麦从2龄到5龄,单株穗重占比逐渐升高,6龄开始降低。6龄田施用氮肥和磷肥均显著提高了老芒麦地上生物量,氮肥增产效果优于磷肥。高氮（N₇₅）处理下6龄老芒麦地上生物量最高。6龄青牧1号老芒麦单穗重在N₆₀处理下最高。长期施肥可有效提高老芒麦地上生物量,N₆₀P₇₅处理下地上生物量最高,在N₇₅P₇₅处理下6龄老芒麦单穗重最高。长期不施肥,6龄老芒麦茎重比例最高。N₄₅P₉₀长期施肥处理下,茎秆重量比例下降,穗重和叶重比例相对增加明显。N₆₀P₉₀和N₇₅P₇₅长期施肥处理下,也可有效提高单株老芒麦穗重的比例。     

不同氮磷水平下不同土层中紫花苜蓿细根周转特征

为探讨不同氮磷配施条件下紫花苜蓿细根周转及不同土层分布动态特征,分析苜蓿细根周转各指标之间的关系。采用双因素随机区组设计进行田间试验,设置4个施磷水平［0（P₀）、50（P₁）、100（P₂）和150 kg·hm^-2（P₃）］和两个氮水平［0（N₀）和120 kg·hm^-2（N₁）］,共计8个处理,通过微根管根系监测0~60 cm的土层细根周转特征。结果表明：在相同施氮条件下,随着施磷量的增加,紫花苜蓿细根总现存量、细根表面积密度、细根生产量和死亡量呈先增加后降低的趋势,在P₂条件下达到最大值,且P₁、P₂处理显著大于P₀处理（P<0.05）,在相同施磷条件下,N₁处理显著大于N₀处理。在不同土层中,在相同施氮条件下,随着施磷量的增加,苜蓿细根现存量在0~30 cm土层中呈先增加后降低的趋势,在0~15 cm土层中,P₂处理苜蓿细根现存量显著高于其他处理（P<0.05）。不同处理下,苜蓿细根现存量主要集中在15~30 cm土层。在相同施氮条件下,随施磷量的增加,苜蓿细根周转率呈先降低后增加的趋势。细根周转率受细根现存量与细根死亡动态变化的影响较大。细根死亡量与周转率拟合的相关系数最大,拟合效果最好。综上所述,当施磷（P₂O₅）量为100 kg·hm^-2、施氮（N）量为120 kg·hm^-2时,能够显著增加苜蓿细根的现存量和根表面积密度,进而促进苜蓿根系周转和生长。     

施氮对苜蓿初花期光合日变化、叶片形态及干物质产量的影响

通过研究不同氮素水平下滴灌苜蓿叶片形态特征、光合日变化规律,分析不同施氮水平下滴灌苜蓿光合日变化、叶片形态与干物质产量的关系,以期进一步揭示施氮对紫花苜蓿干物质及产量形成的影响机制,进而为优化实际生产中紫花苜蓿的氮管理策略提供理论依据。采用单因素随机区组设计,设置0（CK）、60（N₁）、120（N₂）和180 kg·hm^-2（N₃）共4个施氮水平,在紫花苜蓿初花期对光合日变化、叶片形态、叶片氮含量和苜蓿产量构成进行测定。结果表明,施氮处理下苜蓿的叶片净光合速率、蒸腾速率和水分利用效率均高于不施氮处理,施氮处理的苜蓿叶片胞间CO₂浓度低于不施氮处理。对净光合速率和蒸腾速率综合影响最大的环境因子是光合有效辐射。随着施氮量的增加,紫花苜蓿的叶长、叶宽、叶面积、比叶重,以及叶片干重、茎秆干重、干物质产量、叶片氮含量、淀粉和可溶性糖含量均呈先增加后降低的趋势。不同施氮水平下,对叶片形态结构影响最大的为叶面积,其次分别为比叶重、叶长和叶宽,对苜蓿干物质产量影响从大到小依次为叶片氮含量>净光合速率>叶面积>蒸腾速率>比叶重。不施氮和高氮处理下光合速率下降主要是因为光合活性受到抑制,属于非气孔因素。基于主成分分析,干物质产量、叶片形态以及光合作用综合得分最高的为N₂处理,其次分别为N₃、N₁和CK处理。因此,施氮肥有助于紫花苜蓿光合面积和光合速率的协同改进,有利于光合产物的生成,从而促进苜蓿干物质产量的增加,在施氮量为120 kg·hm^-2时提升效果最为明显。     

Wnt5a介导Wnt/Ca2+通路对BCG诱导牛原代肺泡上皮细胞自噬的调控作用

旨在探讨体外分离培养牛肺泡上皮细胞（bovine alveolar epithelial cells,BAECs）的方法及Wnt5a对牛结核分枝杆菌卡介苗（bacille Calmette-Guérin,BCG）感染BAECs细胞自噬的调控机制。试验选用酶联合消化法和机械刮刷法分离细胞,差速贴壁法纯化BAECs,免疫荧光染色检测上皮细胞标志物角蛋白14（cytokeratin 14,CK14）和角蛋白5（cytokeratin 5,CK5）的表达;BCG感染BAECs,并用Box-5抑制Wnt5a的表达,Western blot和免疫荧光染色检测自噬相关蛋白及非经典Wnt信号通路相关蛋白的表达。结果表明,采用酶联合消化法和机械刮刷法能够成功分离纯度较高的BAECs,细胞经CK14和CK5鉴定为阳性;BCG感染BAECs促进Wnt5a表达,增加细胞自噬,Box-5预处理下调BCG诱导的细胞自噬相关蛋白LC3II、P62、Atg7及Atg5的表达,且抑制非经典Wnt/Ca²⁺信号通路相关蛋白Wnt5a、CaMKII及NFAT的表达。综上,试验成功建立BAECs分离培养方法,BCG感染增加BAECs内Wnt5a表达和细胞自噬,抑制Wnt5a下调BCG诱导的BAECs细胞自噬,且Wnt5a是通过非经典Wnt/Ca²⁺信号通路调控BCG诱导的BAECs细胞自噬。     

鸡软骨细胞体外分离培养鉴定以及过表达miR-15a对软骨细胞的影响

为分析miR-15a在肉鸡不同组织中的表达情况,并探究过表达miR-15a对体外培养鸡软骨细胞的影响。本研究首先通过倒置显微镜观察、PCR、凝胶电泳和甲苯胺蓝染色对体外分离培养的软骨细胞进行鉴定。通过实时荧光定量PCR检测miR-15a在肢体内外翻畸形(valgus-varus deformity, VVD)组和健康组肉鸡中(各3只)各组织的表达量。之后通过CCK8和EDU方法分析软骨细胞过表达miR-15a后细胞增殖情况。软骨细胞转染miR-15a mimics后,通过qPCR检测软骨细胞的标志基因Collagen-2、Aggrecan、Collagen-10,成熟分化基因Runx2、Sox9、VEGF、MMP9,炎性因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TGF-β3以及凋亡基因Fas、FasL、Bcl-2的表达量。并构建FKBP5 3'UTR的野生型载体和突变型载体,通过双荧光素酶检测报告检测miR-15a与FKBP5的靶向关系。结果表明,本研究所用的胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶和透明质酸酶联合消化法成功分离得到状态良好的软骨细胞。荧光定量结果显示,miR-15a在各组织中均有表达,与健康组相比,miR-15a在VVD组的肝(P < 0.01)、脾(P < 0.05)、胸腺(P < 0.01)中的表达量显著升高,在心和胸肌组织中的表达量显著降低(P < 0.01)。CCK8与EDU分析结果显示,与NC组相比,过表达miR-15a组软骨细胞增殖速度显著降低(P < 0.01),增殖细胞数量显著减少(P < 0.01)。qPCR结果显示,与mimics NC组相比,miR-15a mimics组的软骨细胞标志基因Aggrecan、成熟分化基因Sox9、Runx2表达量显著降低(P < 0.05),Fas基因表达量极显著上升(P < 0.01),FasL基因和抗凋亡基因Bcl-2极显著下降(P < 0.01)。成功构建了FKBP5 3'UTR野生型和突变型载体,双荧光素酶检测报告结果显示预测的靶基因FKBP5与miR-15a没有靶向关系。本研究成功分离并鉴定了鸡软骨细胞,过表达miR-15a抑制鸡软骨细胞增殖、成熟和分化并促进细胞凋亡。     

育成期饲粮代谢能水平对开产时如皋黄鸡生长发育的影响

本试验旨在研究8～18周龄饲粮代谢能(ME)水平对8周龄至开产时(20周龄)如皋黄鸡生长性能以及屠体、内脏器官、鸡冠、骨骼、消化道和繁殖器官发育的影响。试验选用8周龄体况良好、体重接近的如皋黄鸡360只,随机分成3组,每组8个重复,每个重复15只鸡。8～18周龄,试验鸡分别饲喂ME水平为10.88、11.30和11.72 MJ·kg^-1、其它营养素水平相同的试验饲粮,18周龄～开产(20周龄),各组试验鸡均饲喂相同营养水平的预产期试验饲粮。试验期12周。结果表明：1)随8～18周龄饲粮ME水平增加,蛋鸡18周龄体重、8～18周龄平均日增重(ADG)和平均日代谢能摄入量(MEi)均显著线性增加(P<0.05),8～18周龄和8～20周龄料重比(F/G)和粗蛋白质转化比(CPCR)均显著线性减小(P<0.05)。2)8～18周龄饲粮ME水平对18和20周龄如皋黄鸡屠体、内脏器官和消化道发育均无显著影响(P>0.05)。3)18周龄蛋鸡胫骨重和胫骨率均随8～18周龄饲粮ME水平增加先减小后增加(P<0.05)。8～18周龄饲粮ME水平对18周龄鸡冠和股骨以及20周龄鸡冠、胫骨和股骨发育均无显著影响(P>0.05)。4)18周龄蛋鸡卵巢基质指数和小黄卵泡指数均随8～18周龄饲粮ME水平增加显著线性增加(P<0.05),8～18周龄饲粮ME水平对18周龄其它繁殖器官以及20周龄各繁殖器官发育均无显著影响(P>0.05)。由此可知,8～18周龄饲粮ME水平为11.72 MJ·kg^-1时,能显著增加18周龄体重和8～18周龄ADG,改善8～18周龄F/G和CPCR,促进卵巢基质和小黄卵泡发育,但饲粮ME水平对开产时(20周龄)蛋鸡生长发育指标均无显著影响。本研究表明,将蛋鸡育成期和预产期结合研究具有更重要的实践意义。     

西门塔尔牛、和牛与荷斯坦牛杂种优势预测及实际杂交效果分析

旨在利用覆盖全基因组和性状的特异性SNPs标记预测和牛、西门塔尔牛与荷斯坦牛杂种优势,为牛杂种优势利用和选种选配提供参考依据。本研究分别利用牛Illumina Bovine HD 770 K和GGP Bovine 100 K芯片对464头和牛、1 222头西门塔尔牛和43头荷斯坦牛3个亲本群体进行基因型分型,并通过牛QTLs数据库筛选与目的性状对应的QTLs,对比牛参考基因组映射得到与初生重、周岁重、胴体重性状相关的特异性SNPs;然后构建覆盖全基因组和性状特异性SNPs两种标记状态同源矩阵,通过计算杂交组合亲本间的遗传距离来预测品种间杂种优势,并利用配合力分析验证较优组合的实际杂交效果。结果表明,基于全基因组和性状特异性SNPs计算的各杂交组合遗传距离差异不显著。在全基因组水平上,西门塔尔牛♂×荷斯坦牛♀（S×H）与和牛♂×荷斯坦牛♀（W×H）亲本间杂交组合遗传距离分别为0.346 1和0.338 9;在初生重、周岁重和胴体重性状上,S×H亲本间遗传距离分别为0.343 1、0.348 7和0.336 7,而W×H遗传距离分别为0.337 6、0.340 7和0.329 2;两种SNPs标记计算的遗传距离均为S×H较大,W×H次之。因此,在初生重、周岁重、胴体重性状上,S×H为较优杂交组合。通过分析德系西门塔尔牛♂×荷斯坦牛♀实际杂交群体的配合力,发现10个父系在初生重性状上一般配合力和特殊配合力均为正效应,最高效应值分别达到3.760 9和8.931 2。西门塔尔牛与荷斯坦牛杂交可在初生重、周岁重和胴体重获得较高的杂种优势。     

生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖伪狂犬病病毒工艺优化

旨在筛选伪狂犬病病毒（PRV）敏感的BHK-21细胞并分析其生长和病毒增殖特性,优化反应器中BHK-21悬浮细胞的培养和病毒增殖条件,建立生物反应器培养BHK-21悬浮细胞增殖PRV工艺。本研究利用响应面和单因素优化法,以细胞生长动力学特性、TCID₅₀病毒滴度等参数为指标,优化1.2 L生物反应器中BHK-21悬浮细胞的最佳培养和增殖病毒条件,在5 L生物反应器中进一步批培养验证。结果显示,筛选获得PRV高敏感的BHK-21-02贴壁细胞和BHK-21-XF02悬浮细胞各1株,BHK-21-XF02悬浮细胞在含3%血清的SLM-BHK低血清培养基和SFM-BHK无血清培养基中均能实现良好的生长和病毒增殖。利用响应面法优化得到1.2 L反应器最佳培养条件为接种密度1.20×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速120 r·min^-1、DO值40%,5 L反应器批培养72 h细胞密度可达（7.61±0.18）×10⁶ cells·mL^-1、细胞活率为（96.93±1.18）%。利用单因素法优化得到1.2 L反应器最佳病毒增殖条件为MOI 0.001、培养温度37℃、细胞密度2.0×10⁶cells·mL^-1、搅拌转速80 r·min^-1,5 L反应器批培养接毒后48 h病毒滴度达到最大值（7.13±0.11） lgTCID₅₀·mL^-1。本研究可为PRV疫苗相关研究和规模化生产提供参考。