H4N6亚型禽流感病毒的进化和生物学特性分析

H4N6亚型禽流感病毒(AIV)在全球多个地区的多种动物和鸟类中存在,为了解其对动物和人类健康的潜在威胁,本研究对H4N6亚型AIV A/chicken/Shanxi/S 1452/2018(H4N6)(CK/SX/S1452/2018)株进行了 病毒全基因组测序和遗传进化分析,结果显示该病毒具有明显的遗传多样性,其内...     

H5亚型禽流感病毒单克隆抗体的制备和鉴定

采用高致病性禽流感病毒(HPAIV)H5N1亚型A/Duck/Zhenjiang/11/00(DZJ/1100)毒株作为免疫原,免疫8周龄BALB/C雌性小鼠,三次加强免疫后取脾细胞与SP2/0细胞融合,用表达的重组核蛋白(NP)包被ELISA的方法检测筛选,阳性细胞克隆经有限稀释法克隆培养,最后获得H5亚型特异性的单克隆抗体,抗体亚类检测结果表明该抗体亚类为IgG1型k链抗体。ELISA以及免疫荧光检测表明该抗体有良好的特异性。     

流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1的相互作用

【背景】PA蛋白是流感病毒RNA聚合酶复合体的重要组成部分,在流感病毒基因组的转录和复制过程中发挥重要作用。前期利用酵母双杂交技术(Y2H)筛选与流感病毒PA蛋白相互作用的宿主蛋白,获得多聚胞嘧啶结合蛋白1(poly(r C)-binding protein 1,PCBP1)。【目的】探索PCBP1蛋白与流感病毒PA蛋白的互作关系及其对流感病毒复制的影响,为深入理解流感病毒在宿主体内的复制调控机制提供数据。【方法】将诱饵质粒pGBKT7-PA与筛选到的重组质粒p GADT7-PCBP1以及阴性对照组和阳性对照组按照醋酸锂法分别共转化酵母感受态细胞,并涂布在3种营养缺陷型培养基上,30℃倒置培养5—7 d,观察酵母菌落生长情况和菌落颜色,回交验证PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中的相互作用。参照GenBank中录入的PA蛋白和人源PCBP1蛋白的序列,分别设计特异性扩增引物,构建真核重组表达质粒pCAGGS-Flag-PA和pCAGGS-Myc-PCBP1,将这两种真核表达质粒分别单独转染或共同转染HEK293T细胞,于转染48 h后裂解细胞,收获上清,留取少部分作对照,余下的样品逐步加入FLAG单抗和Protein G琼脂糖珠子进行免疫共沉淀(Co-IP),经SDS-PAGE和Western blot检测PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中的相互作用。利用慢病毒包装系统pLVX-IRES-Zs Green1在HEK293T细胞中包装假病毒,将假病毒侵染A549细胞后经超速流式分选构建PCBP1蛋白过表达细胞系,Western blot检测PCBP1过表达情况,然后用流感病毒WSN以0.01 MOI感染该过表达细胞系,于感染后24和48 h收获上清,对上清中的流感病毒进行蚀斑计数。合成PCBP1蛋白的si RNA,转染A549细胞下调PCBP1蛋白的表达,干扰后48 h通过Western blot检测PCBP1蛋白表达下调情况,并以MOI=0.01感染流感病毒WSN,收获感染后24和48 h的上清,进行蚀斑滴定计数。【结果】通过酵母回交验证发现诱饵质粒pGBKT7-PA与重组阳性质粒p GADT7-PCBP1的共转酵母菌落可以在SD/-2、SD/-4、SD/-4/X/A等3种营养缺陷型平板上正常生长,并且能分解底物X-α-Gal,使菌落呈现蓝色,与阳性对照组一致,表明PA蛋白与PCBP1蛋白在酵母系统中存在相互作用。免疫共沉淀试验发现PA蛋白可以将PCBP1蛋白沉淀下来,说明PA蛋白与PCBP1蛋白在哺乳动物细胞中存在相互作用。在PCBP1过表达细胞系中,PCBP1蛋白表达水平显著提高,流感病毒的复制滴度下降;而通过si RNA干扰后,PCBP1表达水平显著下降,流感病毒的复制滴度升高,表明PCBP1对流感病毒复制具有负调控作用。【结论】通过研究发现流感病毒PA蛋白与宿主蛋白PCBP1在酵母细胞和哺乳动物细胞中均存在相互作用,且宿主蛋白PCBP1对流感病毒的复制具有负调控作用。     

表达禽流感病毒凝素基因的重组禽痘病毒的构建

为构建表达禽流感病毒（ＡＩＶ）血凝素（ＨＡ）基因的重组禽痘病毒,将禽痘病毒启动子ＬＰ２ＥＰ２驱动的Ｈ７亚型ＡＩＶ ＨＡ基因ｃＤＮＡ和大肠杆菌ＬａｃＺ基因插入禽痘病毒疫苗株Ｆ－０１７的复制非必需区。经蓝班筛选后,对重组病毒又进行了３次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板,利用Ｈ７亚型ＡＩＶ ＨＡ基因特异的引物进行聚合酶链式反应,均扩增出１条特异的１．７ｋｂ ＤＮＡ条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验,均检测到ＨＡ蛋白,表明Ｈ７ ＨＩＶ ＨＡ在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为ＡＩＶ病毒活载体疫苗的研制奠定了基础。     

DNA免疫诱导鸡对禽流感病毒的免疫保护反应

为研究DNA疫苗对禽流感病毒（AIV）的保护作用,将禽流感病毒A/Afri.Star./Eng-Q/983/79(H7N1)株血凝素基因cDNA置于SV40启动子和增强子下游,构建了HA基因表达质粒pSVH7。以此质粒肌注免疫3周龄SPF鸡,免疫后第4周用100倍最小鸡胚感染量的HA基因同源病毒人工感染,1周后用棉拭子取样进行泄殖腔病毒分离。免疫后每周及攻毒后第1、2周采血,微量血凝抑制法检测抗体。病毒分离阴性结果：100μg/只组为6/6,10μg/只组为4/6,1μg/只组为5/8,空白对照组为0/6。攻毒后1周相对应的4组血凝抑制价依次为：1∶32～64,1∶16～64,1∶4～64,1∶4～16,表明所构建的H7亚型HA基因表达质粒可诱导鸡产生有效的免疫保护反应。     

H7N9亚型禽流感病毒HA基因mRNA的构建

H7N9亚型禽流感病毒(AIV)持续给家禽及人类健康造成威胁。为构建H7N9亚型AIV (简称H7N9AIV) mRNA疫苗，本研究以AIV分离株A/chicken/Yunnan/SD024/2021 (H7N9)(简称CK/YN/SD024/2021)的HA基因为目的基因、选择来自人β-球蛋白和非洲爪蟾β-球蛋白的不同编码基因序列作为HA基因的非翻译区(UTR)，构建了中间转录质粒p GEM-YN和p XT7-YN，以2个质粒为模板通过体外转录制备了mRNA m H7-YN-p GEM和m H7-YN-p XT7；将2种mRNA转染HEK293T细胞，western blot鉴定结果显示2种mRNA转染的细胞均可检测到约为70 ku的HA蛋白条带和50 ku的HA1蛋白条带；通过间接免疫荧光试验(IFA)确定最适转染剂量和HEK293T细胞中HA蛋白的动态表达，结果显示，3μg mRNA转染106个细胞并于转染24 h后荧光信号强度均最强；将2种mRNA转染鸡胚成纤维细胞(CEF)，均可通过IFA检测到HA蛋白的表达。以上结果表明，本研究正确构建了2种含H7N9 AIV HA基因的m...     

一株野鸟源H5N8高致病性禽流感病毒的遗传演化分析及生物学特性研究

2021年本实验室从发病野鸟组织样品中分离到一株H5N8亚型禽流感病毒(AIV)，命名为A/black-headed gull/Tibet/1-2/2021(H5N8)，简称为BH Gull/TB/1-2/2021(H5N8)。为进一步了解该病毒的生物学特性，本研究对其基因组测序并经遗传演化分析，结果显示，该病毒HA蛋白的裂解位点为PLREKRRKR↓GLF，符合高致病性AIV(HPAIV)的分子特征。在遗传进化上HA基因属于2.3.4.4b分支，外部基因与部分内部基因(PB1、PA、NP、NS)均与2020年～2021年分离到的H5N8亚型AIV相应基因的同源性最高，且处于同一分支；PB2基因与一株H9N2亚型AIV PB2基因同源性最高，为99.25%;M基因与近两年流行的2.3.4.4b分支H5N1亚型AIV同源性最高，且处于同一分支，推测该病毒为一株重组病毒。抗原性分析结果显示，该病毒与2.3.4.4分支H5-Re8、2.3.4.4b分支H5-Re14疫苗株抗原性相近。不同哺乳动物细胞系生长曲线结果显示，该病毒可在哺乳动物细胞系中有效复制，但其在A549中的复制效率高于其在MD...