DNA疫苗制备工艺研究

以禽流感DNA疫苗pCAOH5转化大肠杆菌JM109后,利用发酵罐进行发酵培养。将菌体悬浮裂解中和后,经澄清和浓缩处理,利用阴离子交换色谱对其进行纯化。结果表明实验室规模的技术路线完全能够为质粒DNA的工业化制备奠定技术基础。     

共表达禽流感病毒HA和NA基因的重组禽痘病毒在SPF鸡的免疫效力试验

 将禽流感病毒A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)毒株的HA和NA2个基因同源重组到禽痘病毒基因组中,获得了能同时高效表达这2种蛋白的重组禽痘病毒(rFPV-HA-NA)。将rFPV-HA-NA经翅膀刺种途径接种8周龄SPF鸡,免疫后4周分别用10LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)和A/FPV/Rostock/34(H7N1)毒株进行攻击。结果重组禽痘病毒免疫鸡群诱导产生了高水平的抗体,能够完全抵抗H5N1和H7N1亚型病毒的     

禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达

为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达。首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIVHA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA NP)。将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞。根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及West-ern-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIVHA及NP两种蛋白。此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础。     

HA基因密码子及表达载体优化的H5亚型禽流感DNA疫苗免疫保护效果比较

为评估HA基因密码子优化及不同表达载体对H5亚型禽流感DNA疫苗免疫效果的影响，pCIHA5、pCAGGHA5 、pCIoptiHA5和 pCAGGoptiHA5分别以100 和10 μg剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后分别用100 LD50的高致病力禽流感病毒(HPAIV) A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]鼻腔途径进行攻击，观察发病与死亡情况，分别于攻毒后第3、5和7无采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况，同时检测免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗体、AGP抗体的动态变化，对4种疫苗单次免疫的免疫保护效果进行比较评估。结果表明，100 μg剂量组中， pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5 均可对免疫鸡形成100％完全保护（不发病、不致死和不排毒），pCIoptHA5(75%) 和pCIHA5(50%)仅可形成部分免疫保护；10 μg剂量免疫组中， pCAGGoptiHA5和pCAGGHA5 可对免疫鸡形成100％的保护（不发病和不致死），pCIoptiHA5可形成对免疫鸡的部分免疫保护(75%)，而pCIHA5则基本不能形成免疫保护。结果表明，HA基因密码子的优化以及鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果同时证明，通过密码子和载体的优化，可使H5亚型禽流感DNA疫苗有效免疫保护剂量降低至10 μg，其推广应用已具备充分的经济可行性。pCAGGoptiHA5作为免疫效果良好、成本低廉的优化DNA疫苗，有望成为预防H5亚型高致病力禽流感的高效、安全新型基因工程疫苗。     

维生素A与动物疾病

近年来已经证明 ,维生素Ａ在抗感染、抗肿瘤、提高机体免疫力等方面具有重要作用。１维生素Ａ与传染病维生素Ａ的抗感染能力是通过保持细胞膜的强度而使病毒不能穿透细胞。病毒本身不能复制 ,它必须进入细胞内利用细胞的繁殖机制来复制自己。维生素Ａ通过对细胞膜的保护作用而增强机体的抗感染能力 ,这与抗体、干扰素的抗感染机制不同 ,但却是很重要的。当维生素Ａ缺乏时 ,呼吸道感染性增加 ,补充维生素Ａ则发病率下降。有资料报道 ,每天给猪补充３ %鱼肝油、ＶＥ２００ｍｇ、硒０ ２ｍｇ,能显著地提高对猪痢疾的抵抗力。也有人报道 ,仔猪日…     

以GPT和GFP为双重筛选标记的禽痘病毒转移载体的构建及鉴定

为研制和开发以禽痘病毒为载体的重组病毒疫苗,本研究构建了禽痘病毒通用转移载体pSY681-gfp-gpt,该载体含有gfp和gpt2种报告基因及背对的痘苗病毒晚期启动子P11和早期启动子P7.5,P11启动gfp和gpt两个基因,P7.5用于启动外源基因,在早期启动子P7.5下游引入NotⅡ和AftⅡ两个酶切位点.用于外源基因的插入.为检测禽痘病毒转移载体pSY681-gfp-gpt的有效性,将H9亚型禽流感病毒A/Chicken/Shanghai/10/01(H9N2)的HA基因插入到该载体中构建转移载体pSY681-gfp-gpt-HA9,将转移载体转染已感染禽痘病毒S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞,利用gfp和gpt同时进行双重筛选、数轮蚀斑纯化后获得了重组病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,通过PCR、western blot鉴定,结果证明,获得了能稳定表达H9亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒rFPV-gpt-gfp-HA9,为今后重组禽痘病毒活载体疫苗的研制奠定了基础.     

防风枯斑病的病原学及药剂敏感性

试验研究了防风枯斑病的病原学和病菌生物学特性及其药剂敏感性。通过病菌的分离及柯氏证病,获得3株病原菌;结合病原形态特征、培养学特性及r DNA-ITS、TUB2和TEF序列分析,确定引起防风枯斑病的病菌为Diaporthe angelicae。病菌生物学研究表明:菌丝生长及孢子产生的最适温度为25℃,最适p H为8;病菌在以麦芽糖和蔗糖为主要碳源的培养基上生长和产孢最佳;在以天门冬酰胺为主要氮源的培养基上生长最佳。病菌分生孢子在25℃时萌发率最高,孢子的致死温度为35℃;分生孢子在p H 8时萌发率最高;全光照有利于分生孢子萌发。病菌对23种杀菌剂的敏感性测定结果表明:病菌对30%氟菌唑WP、3%己唑醇·27%稻瘟灵EC、40%氟硅唑EC、55%硅唑·多菌灵WP、25%丙环唑EC、30%苯醚甲环唑SC、30%醚菌酯WP、250 mg/L吡唑醚菌酯EC、10%苯醚甲环唑WG、77%硫酸铜钙WP的敏感程度较高,其EC500.1 mg/L。     

表达H5亚型禽流感病毒HA蛋白的重组禽痘病毒的构建

为构建表达H5亚型禽流感病毒(AIV)A/Duck/Anhui/1/06(H5N1)(简称AH/06)HA蛋白的重组禽痘病毒,本研究利用感染-转染的方法通过转移载体pSY681-gfp-gpt将AIV株AH/06的HA基因同源重组到禽痘病毒(FPV)中,并利用gfp和gpt双重筛选标记在鸡胚成纤维细胞中经过多轮筛选,得到纯化的重组禽痘病毒(rFPV-gfp-gpt-AHHA)。通过PCR、序列测定和western blot的方法对rFPV-gfp-gpt-AHHA进行鉴定和抗原活性分析。结果表明AH/06的HA基因稳定的重组到rFPV-gfp-gpt-AHHA中,其表达的HA蛋白能够与AH/06的阳性血清反应,显示出了良好的抗原性。同时病毒的生长曲线也显示外源HA基因的插入并没有影响亲本病毒的复制。这些结果为进一步的免疫效力研究奠定了基础。     

抚州市农机化宣传工作超历史

为了加大农机化宣传力度，抚州市农机局采取行之有效的过硬措施，促使农机化宣传工作上档次、上台阶，局机关宣传报导工作创造了农机发展史上的奇迹，各项工作呈现出前所未有的大好局面。主要体现在：规格高领导重视超历史２００２年，局机关在省委党报和《中国农机化报》上刊稿６篇，局长刘明亮先后在《江西日报》、《抚州日报》、《中国农机化报》发表“明晰思路、开拓创新”、“四轮驱动、兴机富民”、“抢农机”、“抚州扶持发展农机大户”等文章，给全局以巨大的鼓舞。数量多撰稿数量超历史据粗略统计，全局２００２年撰稿总量（含抚州…