泰国输华斑节对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒的检测与分析

为研究进口斑节对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)的风险,本文采用了世界动物卫生组织(OIE)2015版手册中推荐的PCR方法,对2015年从泰国输华的329批次斑节对虾进行了IHHNV检测分析。结果发现,其阳性率高达36.8%,且主要是感染1型和2型,以及风险不明的未知型。因此,来自泰国的斑节对虾具有较高的IHHNV传入风险,应加强针对IHHNV的进口监测,减少其对我国对虾养殖的影响。     

传染性鲑鱼贫血症病毒实时荧光环介导等温扩增检测方法的建立

根据ISAV的基因保守序列,利用LAMP Designer软件设计了6条引物,采用新型的环介导等温扩增设备进行扩增和检测,优化了反应条件,分析了所建立方法的特异性和灵敏度,并与RT-PCR和实时荧光RT-PCR进行比较。研究表明,该方法最适反应温度为64℃,反应10 min就可以观察到明显的扩增。该方法灵敏度高,检测限为78.4 fg RNA,比常规RT-PCR灵敏度高100倍,与实时荧光定量RT-PCR灵敏度相当;特异性好,与传染性胰腺坏死病毒(IPNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、出血性败血症病毒(VHSV)、鱼类病毒性神经坏死病病毒(VNNV)、鱼腹水病毒(YAV)等14种主要鱼类病毒没有交叉反应。结果表明,本研究建立了ISAV的实时荧光环介导等温扩增检测方法,实验能对整个扩增过程进行实时监测,提高检测灵敏度的同时,防止由于开盖跑电泳或加染料而导致的污染。     

两株传染性造血器官坏死病病毒的分离及其糖蛋白基因序列分析

对所分离编号为20101008和20101032的两株传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）的糖蛋白编码基因进行遗传进化分析,以揭示我国毒株与其他不同国家和地区毒株间的遗传进化关系。以反转录RCR（RT-PCR）法扩增其糖蛋白（G）编码基因,然后克隆入PMD-18T载体并测序。应用DNAStar和MEGA4.0软件,将20101008和20101032的G基因与多株GenBank中已发表的IHNV毒株相应基因进行比较。结果表明两株病毒间G编码基因的核苷酸和推导出来的氨基酸同源性分别为98%和81.9%,其氨基酸序列分别发生了35和20处氨基酸的替换。20101008和20101032与日本、韩国分离株同源性较高,核苷酸及推导出来的氨基酸同源性分别为93.3%～96.4%和75.9%～84.6%;两株病毒在进化关系上亲缘关系最近,属于同一分支,均为基因U型传染性造血器官坏死病病毒,但其G基因的核苷酸序列以及推导出来的氨基酸序列与已知的基因U型IHNV都有一定的差异。     

石鲽鱼鱼苗中一种弹状病毒的分离与鉴定

从养殖石鲽鱼(Kareius bicoloratus)鱼苗中分离到1株弹状病毒(080113株).用研磨离心除菌后的组织匀浆液,接种11种鱼类细胞系.结果在鲤上皮瘤细胞(EPC)和肥头鲤细胞系(FHM)等8种细胞中均出现明显的细胞病变(Cytopathic effect,CPE),在鲤上皮瘤细胞(EPC)中的滴度最高.对该毒株的理化性质进行了测定,结果显示080113株对温度和pH敏感;对5′-碘-2′脱氧尿密啶(IUDR)不敏感;对氯仿敏感,提示是一种有囊膜的RNA病毒.制备电镜超薄切片,观察到在细胞质中有大小为(80～118)nm×(28～55)nm、形态为典型的弹状的病毒粒子.SDS-PAGE电泳分析该毒株的蛋白质图谱,结果表明该毒株有5条主要的蛋白带,相对分子质量大小分别为200 000、56 000、42 000、29 000和24 000.用传染性造血器官坏死病毒(IHNV)、病毒性出血性败血症病毒(VHSV)和牙鲆弹状病毒(HRV)等水生动物弹状病毒特异性引物对该毒株进行逆转录聚合酶链式反应,结果用HRV的引物能扩增出阳性片段.对该片段进行测序分析,发现与HRV的参考序列有99%以上的相似性.因此,初步鉴定该毒株为牙鲆弹状病毒.     

实时定量PCR快速检测对虾白斑综合症病毒

根据对虾白斑综合症病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)的保守序列,利用Primer Express2.0软件设计引物和Taqman探针,建立了WSSV的实时定量PCR检测体系.构建含有WSSV目的扩增片段的质粒为标准品,进行定量PCR扩增,结果表明标准品浓度在1.5×107～1.5×101个拷贝之间有"S"型扩增曲线,检测限为15个拷贝.标准曲线中模板浓度(X)与Ct值的关系为:Ct=-3.77 lgX+43.73,相关系数R2=0.9967.该检测方法特异性强,对传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、斑节对虾杆状病毒(MBV)、肝胰腺细小病毒(HPV)以及对虾基因组DNA没有扩增反应.运用该方法对100尾对虾样品进行检测,14个对虾样品为阳性.而运用巢式PCR检测只有4个对虾样品为阳性.实时定量PCR方法检测WSSV,快速、特异、灵敏,在虾病的临床检测上具有重要意义.     

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)特性和对鲤春病毒的敏感性

草鱼(Ctenopharyngodon idellus)性腺细胞系(GCO)是中国科学院水生生物研究所在20世纪70年代开展草鱼出血病研究时建立的一株细胞系,迄今已传至300多代,在中国鱼类病毒学研究领域发挥了重要作用.本研究采用形态学观察、细胞生长曲线测定、细胞周期测定、细胞核型分析、细胞凋亡检测、电镜观察等方法,对GCO的生长特性及鲤春病毒血症病毒(SvCv)在该细胞中的增殖特性等进行了研究.结果显示,GCO细胞的最适生长温度为25℃,在M199和MEM等细胞培养液中均能较好地生长,培养液中最适的胎牛血清浓度为10％.测定了GCO细胞系对SVCV病毒的敏感性,发现与鲤(Cyprinus carpio)上皮瘤细胞系(EPC)、肥头鲤(Pimephales promelas)细胞系(FHM)、大鳞大麻哈鱼(Oncorhynchus tshawytscha)胚胎细胞系(CHSE-214)等世界动物卫生组织(OIE)推荐和各检测实验室常用的鱼类细胞系相比,GCO细胞系对SVCV表现出非常高的敏感性.生长盐线、电镜观察和凋亡实验显示,SVCV能引起GCO细胞系出现明显而稳定的细胞病变,引起GCO细胞系出现凋亡,并在细胞质中大量增殖.结果表明,GCO细胞系适用于SVCV病毒的分离、检测以及病毒致病性的有关研究.GCO细胞的适宜生长温度为15-28℃,这一特点将使它可以广泛地用于多种水生动物病毒的分离.     

虹彩病毒蛙病毒属病毒实时荧光PCR检测方法的建立

在GenBank 中搜寻虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白(MCP)基因序列并进行多重比较后,利用其中的保守序列,设计引物和Taqman探针,建立了虹彩病毒蛙病毒属实时荧光PCR检测方法.对荧光PCR反应条件进行优化,评估该检测方法的特异性、稳定性和重复性,利用10倍系列稀释法检验其灵敏度并与常规PCR做了比较.结果显示,该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员(新加坡石斑鱼虹彩病毒除外)的检测有高度的特异性,与淋巴囊肿病毒、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒、真鲷虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒等其他水生动物病毒之间均无交叉反应,有良好的特异性,检测总DNA灵敏度为4.5×10-3pg/μL,比传统PCR的敏感度高出100倍,可对低病毒含量的样品进行准确检测.制作的标准曲线有极好的线性关系,且线性范围宽,相关系数为0.998 4.组内和组间重复试验的Ct值标准偏差分别为1.2%和1.6%,有良好的重复性.与常规的PCR相比较,该方法具有快速、特异、敏感、可定量、可同时检测大量样品等优点,可用于出入境检疫和动物防疫监督部门对虹彩病毒蛙病毒属的疫情监测.     

鱼类病毒性神经坏死病毒的分离和部分特性研究

收集福建某渔场的患病石斑鱼苗制备组织切片,同时将患病石斑鱼苗组织匀浆后接种到条纹月醴细胞系(striped snakehead, SSN-1),对发生细胞病变(cytopathic effects, CPE)的SSN-1细胞进行逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、纯化负染,并制备细胞超薄切片,借助SSN-1细胞系从患病石斑鱼苗中分离病毒性神经坏死病毒(viral nervous necrosis virus, VNNV).试验结果表明:在病鱼脑和视网膜中可见大量的空泡,接种SSN-1后2～3d出现CPE,PCR检测可扩增出VNNV特异性带,提示这是VNNV病毒.负染及SSN-1细胞超薄切片的电镜观察显示,该病毒为直径25～30nm的二十面体病毒粒子,在胞质中呈不完全晶体状排列,同时细胞质中有大量空泡,进一步说明分离株为VNNV.对该分离株进行细胞敏感性试验、脂溶剂敏感试验(氯仿处理)、热敏感试验(55℃ 30min)、酸碱敏感试验(pH值为3和pH值为11各1h),试验结果表明:石斑鱼吻端细胞、鲤上皮瘤细胞、肥头鲤细胞在28℃、25℃、20℃时对该病毒都不敏感;该病毒对氯仿不敏感,对热和酸碱都比较敏感.研究结果表明,用SSN-1细胞系可以从患病鱼中分离VNNV.