猪流行性腹泻病毒S蛋白纳米抗体的筛选与鉴定

猪流行性腹泻病（porcine epidemic diarrhea,PED）是一种高度接触性肠道传染性疫病,主要危害1周龄以内的仔猪,仔猪感染死亡率高达100%,是目前危害世界养猪业的主要疫病之一。本研究旨在制备针对猪流行性腹泻病毒S蛋白的特异性纳米抗体并鉴定其结合活性。作者原核表达并纯化PEDV S1蛋白,将纯化后的PEDV S1重组蛋白免疫双峰驼,第4次免疫后分离其外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞RNA,反转录得到cDNA,通过巢式PCR扩增VHH片段,并构建至pCANTAB-5E载体中,电转化至TG1感受态细胞,得到VHH噬菌体抗体展示文库;随后,对构建的噬菌体抗体展示文库进行救援和3轮富集,利用噬菌体展示技术从中筛选针对PEDV S蛋白纳米抗体,通过ELISA验证筛选的纳米抗体的特异性和结合力。通过Western blot和间接免疫荧光验证纳米抗体与PEDV的结合活性。结果显示：成功表达并纯化PEDV S1蛋白,经4次免疫后,双峰驼血清中的特异性抗体效价达到了1∶256 000。构建的噬菌体展示文库的库容量为2.1×10⁷,阳性率85%;对噬菌体展示文库3轮的淘选富集后,最终筛选出6株氨基酸序列不同的纳米抗体,ELISA结果显示,6株纳米抗体均对PEDV S1重组蛋白具有良好的结合力与特异性。随后验证了Nb3能够与PEDV结合,表明其具有良好的活性。成功筛选到针对PEDV S1蛋白的特异性纳米抗体,所筛选纳米抗体有望用于PED的诊断和治疗,同时为PEDV的致病机制研究提供抗体材料。     

白酒糟饲料化开发利用及其对贵州石漠化地区的启示

根据国家石漠化综合治理草地畜牧业工程的需要,应用营养学、饲料学等学科理论,本文对贵州喀斯特石漠化地区白酒糟资源的利用价值进行了综合评价,包括其营养价值、饲用价值、生态价值和经济价值。同时针对白酒糟饲料化开发利用过程中存在的加工技术滞后、理论研究不足、地域条件限制等问题进行了分析,提出了运用青贮法和微生物发酵等关键技术、强化基础理论研究、构建饲料加工中心等相应解决对策,并指出大力发展以白酒糟为原料的非常规饲料加工业是喀斯特石漠化地区发展生态畜牧业的重要举措,也是巩固石漠化治理成果的有效办法。     

施用有机肥对当归药材性状、产量及抗病性的影响

为了探寻有机肥对当归成药栽培的影响,采用黑膜覆盖栽培,基施纯有机肥（O,2000 kg·hm^-2）、纯化肥（C,磷酸二铵,420 kg·hm^-2）、减半量化肥增施有机肥［1/2（O+C）］,以不施肥为对照（CK）,栽培期测定早期抽薹率、发病率、药材产量和性状指标。结果表明,纯有机肥栽培当归早期抽薹率为8.0%,分别较CK、1/2（O+C）和C降低19.4%、15.2%和7.1%。药材产量则相反,O、C和1/2（O+C）栽培当归药材产量相当,鲜产量分别较CK提高105.9%、84.6%和78.2%。纯有机肥栽培当归根最长,侧根最多,单根最重,药材产量最高。化肥对根的增粗作用最大,但含水量高,根病率高,发病重。不同施肥每hm²鲜药材产量与综合评价指数大小顺序一致,依次为O（9220.6 kg,0.926）>C（9038.5 kg,0.610）>1/2（O+C）（8728.4 kg,0.481）>CK（4897.4 kg,0.190）。每hm²干药材产量排序为O（3149.2 kg）>1/2（O+C）（3098.7 kg）>C（2909.2 kg）>CK（1707.0 kg）,与经济收益一致。在岷县道地产区黑膜覆盖栽培,纯施有机肥对当归药材具有显著增效作用,可有效降低早薹率、根病率和发病程度,改善药材性状,提高药材产量和质量,在当归标准化栽培中可推广应用,以改变当归依赖化肥的生产现状,促进绿色有机栽培。     

锰胁迫下鸡眼草的富集特征及生理响应

为探明植物对锰胁迫的耐受性机制,以采自重金属污染区与非污染区的鸡眼草为试验材料,在不同锰浓度胁迫下［0 （对照）、1000、5000、10000、15000、20000 μmol·L^-1］ 开展盆栽试验,比较研究锰胁迫对两种来源鸡眼草表型、生理生化特性及锰积累特征的影响。结果表明：随着锰浓度的升高,1） 两种来源鸡眼草的根干重、芽干重、根冠比均呈降低的趋势;当锰浓度达5000~20000 μmol·L^-1时,与对照相比,污染区、非污染区鸡眼草的芽干重分别下降4.34%~27.71%与16.33%~49.77%,根干重分别下降19.00%~66.06%与27.90%~77.54%,污染区下降幅度均较非污染区的小;2） 两种来源鸡眼草的叶绿素、可溶性糖、脯氨酸含量及超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）活性均呈先升后降的趋势,可溶性蛋白含量逐渐下降,丙二醛（MDA）含量则逐渐升高;3） 两种来源鸡眼草根、茎、叶的锰含量均增加;锰浓度为20000 μmol·L^-1时,污染区和非污染区鸡眼草的叶锰含量分别为对照的16.53和13.41倍。因此,污染区鸡眼草锰耐受能力及富集能力均较非污染区鸡眼草高,较高的抗氧化酶活性是其耐受高锰胁迫的重要生理机制。     

三江源退化高寒草原植物种间亲和性和土壤团聚体特征

为研究三江源地区不同退化程度的高寒草原土壤团聚体和种间亲和性特征,以轻度、中度、重度和极度退化草地为研究对象,对土壤特征和群落特征进行测定。结果表明：随着退化程度的加剧,同一土层相同粒径土壤颗粒的分形维数逐渐减小,>0.5 mm粒径土壤团聚体占比下降、平均重量直径减小,<0.5 mm粒径土壤颗粒的平均重量直径增大,各粒径团聚体分布受土层深度影响较小;中度退化草地物种多样性最高,其种间相关性也最为复杂;随退化程度加剧,正联结种对占比增大,而负联结种对占比下降,种对间的相关性和性质也发生显著变化;退化过程中土壤沙化明显,群落建群种发生变化、杂类草比例显著增加,种对间相关性趋于简单,种间竞争强度逐渐降低。因此,在草地退化过程中维持群落种间亲和性,可有效遏制土壤沙化和草原进一步退化。     

补播羊草和黄花苜蓿对退化草甸植物群落特征的影响

呼伦贝尔草原区是我国北方重要的生态屏障,近年来不合理的利用方式导致该地区退化草地面积不断扩大,为了探究牧草补播时间及补播比例对呼伦贝尔退化草甸草原植物群落特征的影响,为该地区退化草地修复提供依据。本研究以羊草（Leymus chinensis（Trin.） Tzvel.）和黄花苜蓿（Medicago falcata L.）为试验材料,采用双因素随机区组试验设计,通过测定幼苗数、高度、生物量等群落指标,并综合评价补播效果,结果表明：夏播羊草和黄花苜蓿幼苗数量显著高于春播和秋播（P<0.05）,夏播和秋播植物群落总生物量呈增加趋势,春播则呈减少趋势;补播措施提高了退化草地植物群落Shannon-Weiner指数、Simpson指数和Pielou指数,豆科和禾本科植物重要值呈增加趋势,其他科植物呈下降趋势。呼伦贝尔地区夏季补播羊草和黄花苜蓿以1∶3补播效果较好,而春播由于恢复时间短,需进一步观察。     

宁夏回族自治区养殖粪污资源化利用现状调查与分析

畜禽粪污资源化利用,是农村生态环境保护工作的重点和难点,对于改善农村生态环境质量、提高农业绿色发展水平、促进农产品增产提质具有重要意义。本文为进一步了解宁夏回族自治区（简称“宁夏”）畜禽粪污资源化利用现状,在宁夏银川市、石嘴山市、吴忠市、中卫市、固原市5 市,对四大产业主导区畜禽养殖产业基本情况、全区及各市不同类型和规模的畜禽养殖粪污资源化利用现状及问题、不同养殖类型和规模的资源化主推技术及典型案例等情况进行了实地调研。结果表明：2020年,宁夏畜禽存栏总量2 046.0 万头（只）,其中,奶牛57.4 万头、肉牛120.7 万头、羊596.1 万只、生猪90.0 万头、家禽1 181.8 万只。畜禽粪污产生量3 025.3 万吨,全区粪污资源化利用总量为2 961.6 万吨,综合利用率达到97.9%,规模养殖场设施配套率达99.0%,该地区畜禽粪污综合利用主要途径有肥料化利用、能源化利用、清洁再生回用等。     

猪戊型肝炎病毒ORF3蛋白影响HepG2细胞核黄素代谢的lncRNA-mRNA调控网络的鉴定

为初步鉴定并挖掘出猪戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)ORF3蛋白影响HepG2细胞核黄素代谢信号通路的lncRNA-mRNA调控网络,本试验通过构建腺病毒过表达载体,制备高滴度过表达腺病毒,介导猪 HEV-ORF3在HepG2细胞中实现过表达。Western blotting检测ORF3蛋白过表达成功后,运用lncRNA高通量组学测序,筛选出差异表达的lncRNA并进行靶向差异基因预测,对lncRNA靶向差异基因进行GO功能和KEGG通路富集分析,初步鉴定出与核黄素代谢信号通路相关的lncRNA-mRNA调控网络。Western blotting结果显示,在约为12 ku处出现目的条带,说明成功实现腺病毒介导猪HEV-ORF3在HepG2细胞中过表达。lncRNA高通量组学测序结果显示,共发现102个显著差异表达lncRNAs表达量上调,80个显著差异表达lncRNAs表达量下调。GO功能和KEGG通路富集分析显示,初步挖掘出lncRNA(MSTRG.13995.2)和lncRNA(MSTRG.1960.1)可能是与核黄素代谢信号通路相关的显著差异表达lncRNA,分别通过顺式调控其靶向基因APC-5和FLAD1来影响核黄素代谢信号通路。本试验初步鉴定出lncRNA(MSTRG.13995.2)-APC5和lncRNA(MSTRG.1960.1)-FLAD1可能是影响HepG2细胞核黄素代谢信号通路的lncRNA-mRNA调控网络。     

Expression Analysis of THBS3 Gene in Different Tissues and Skeletal Muscles at Different Periods from Landrace and Tongcheng Pigs

To study the expression pattern of THBS3 gene in different tissues and during skeletal muscle development, the THBS3 gene expression in different tissues and skeletal muscles during prenatal periods (33, 45, 65, 70 and 90 d) and postnatal periods (0, 9, 30, 60, 120 and 160 d) from Landrace and Tongcheng pigs were detected by Real-time quantification PCR.The results showed that THBS3 gene widely expressed in all tissues examined, exhibiting similar spatial expression patterns with expression peaks in lung in both pig breeds except in stomach and intestine.Moreover, although THBS3 gene showed a significant higher expression level in gestation than after birth in Landrace and Tongcheng pigs (P<0.05), it exhibited different expression patterns between Landrace and Tongcheng pigs, the expression peak was detected at gestation day 45 in Landrace pig, while was detected at gestation day 65 in Tongcheng pig.The results suggested that THBS3 gene involved in skeletal muscle growth and development in pigs, as well as the regulation of asynchronization of skeletal muscle development in different pig breeds.     

Establishment of a Duplex Real-time RT-PCR Assay for the Differential Detection of Nipha Virus and Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus

To establish a rapid,sensitive and specific assay for the differential detection of Nipah virus (NiV) and highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV),a duplex Real-time RT-PCR was developed with specific primers and probes targeting to the special sequences of NiV M gene and HP-PRRSV nsp2 gene by optimization of reaction conditions.The performance of the assay was linear ranging from 4.6×10¹ to 4.6×10⁷ copies/μL for RNA standard control of NiV M (NiV-M-RNA) and from 4.1×10¹ to 4.1×10⁸ copies/μL for RNA standard control of HP-PRRSV nsp2 (HP-PRRSV-nsp2-RNA),and detection limits of the assay was 46 copies for the NiV-M-RNA and 4.1 copies for the HP-PRRSV-nsp2-RNA,respectively.The coefficients of variation (CVs) of both inter-assay and intra-assay repeatability were less than 2.0%,showing good repeatability.The assay was able to specifically detect NiV and HP-PRRSV simultaneously without cross-reaction with classical swine fever virus (CSFV),porcine epidemic diarrhea virus (PEDV),swine influenza virus (SIV),porcine parvovirus (PPV),pseudorabies virus (PRV) and porcine circovirus type 2 (PCV2).Of the 236 samples from pigs for both NiV and HP-PRRSV detection by the established assay,all the samples were negative for NiV,8 samples were HP-PRRSV positive.In conclusion,this assay offers a useful approach for the differential detection of NiV and HP-PRRSV in clinical specimens from the pigs.