葡萄溃疡病菌巢式PCR高效检测体系的建立

葡萄溃疡病（grape canker）在世界葡萄种植区普遍发生,可引起葡萄的顶梢枯死、枝干溃疡、果实腐烂等症状,严重时可导致植株整株死亡,给葡萄生产造成严重危害[1]。已知葡萄座腔菌科Botryosphaeriaceae中的17个种可引起葡萄溃疡病[1]。     

葡萄灰霉病菌对3种杀菌剂的多重抗药性检测

【目的】为检测葡萄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利和乙霉威3种杀菌剂的多重抗药性,指导生产上葡萄灰霉病的药剂防治。【方法】从甘肃、山东、北京等14个省、市、自治区采集葡萄灰霉病样分离纯化得到109个灰葡萄孢(Botrytis cinerea)单孢系菌株,采用最低抑制浓度法(MIC)测定了葡萄灰霉病菌对苯并咪唑类(多菌灵)、二甲酰亚胺类(腐霉利)和氨基甲酸酯类(乙霉威)杀菌剂的多重抗药性。【结果】结果表明,葡萄灰霉病菌对多菌灵、腐霉利和乙霉威的抗药性菌株率分别达到了83.5%、14.7%和17.4%;抗药性类型有BenRDicSNPCS、BenRDicRNPCS、BenRDicRNPCR和BenSDicSNPCR4种,所占比例分别为68.8%、13.8%、0.9%和16.5%。【结论】我国不同地区的葡萄灰霉病菌对苯并咪唑类、二甲酰亚胺类和氨基甲酸酯类杀菌剂普遍存在抗药性问题,对多菌灵的抗药性较为严重,因此,在生产上,应选择一些替代的新型杀菌剂和生物农药。     

可可毛色二孢全基因组分泌蛋白的预测及分析

【目的】可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）是一种世界性分布的重要植物病原真菌,可引起严重的葡萄溃疡病（Botryosphaeria dieback）,影响果木品质并造成巨大的经济损失。本研究预测并分析可可毛色二孢基因组范围内的分泌蛋白,并明确其基本特征,为该病菌分泌蛋白致病机理的研究打下基础。【方法】依据已公布的可可毛色二孢全基因组序列,利用信号肽预测软件SignalP v5.0、跨膜结构分析软件TMHMM v2.0、细胞器定位分析软件ProtComp v9.0、GPI锚定预测软件big-PI Fungal Predictor和亚细胞器定位分析软件TargetP v2.0生物信息学软件对该菌中的典型分泌蛋白进行筛选。对分泌蛋白N端信号肽的长度、氨基酸使用频率及其切割位点进行统计分析。依据蛋白序列的同源性,应用BLASTP程序对分泌组蛋白进行功能注释分析,预测其生物学功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统,对所选分泌蛋白的信号肽进行活性检测。利用qRT-PCR方法检测所选分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表达情况。【结果】在可可毛色二孢全基因组编码蛋白中共筛选获得552个潜在的具有典型信号肽的分泌蛋白,占全基因组预测蛋白总数的4.3%,其编码蛋白长度集中于101—400 aa。信号肽统计分析表明,其信号肽长度以18—20 aa的序列最为集中,信号肽长度为20 aa的蛋白数量最多。信号肽中使用频率最高的氨基酸为丙氨酸;非极性、疏水的氨基酸使用频率最高,占氨基酸总数的60.2%。其信号肽的-3至-1位置上的氨基酸相对保守,切割位点属于A-X-A类型,可被Sp I型信号肽酶识别并切割。336个分泌蛋白具有功能注释,其功能较多集中于细胞壁降解有关的酶类以及致病相关蛋白,并且这些蛋白在分子量、等电点、脂肪族氨基酸指数等方面均存在差异。通过蔗糖酶缺陷的酵母分泌系统证实,挑选的9个分泌蛋白信号肽均具有分泌活性。qRT-PCR检测结果表明,所选分泌蛋白基因在该病菌侵染初期的表达发生变化。【结论】利用生物信息学分析技术从可可毛色二孢全基因组中共预测获得552个经典分泌蛋白。其信号肽氨基酸长度分布广泛,氨基酸组成中非极性、疏水的氨基酸使用频率最高。功能注释主要集中在细胞壁组分降解相关的酶类、致病侵染相关的坏死诱导相关蛋白以及几丁质结合蛋白等。     

甘蓝枯萎病菌原生质体的制备与再生条件的优化

建立甘蓝枯萎病菌（Fusarium oxysporum f.sp. conglutinans）高效遗传转化体系的途径之一是获得其具有再生功能的原生质体。本研究通过对甘蓝枯萎病菌菌丝摇培时间、菌丝的酶解时间、保护原生质体的渗透压稳定剂的种类和浓度等因素进行优化,建立了制备甘蓝枯萎病菌原生质体的高效、稳定体系,并在SR固体培养基上实现了甘蓝枯萎病菌原生质体的再生,再生率可达21.13%。该体系的获得将为下一步甘蓝枯萎病菌高效遗传转化体系的建立和致病机理的解析奠定基础。     

可可毛色二孢菌侵染后的烟草酵母双杂交cDNA文库构建

正葡萄是世界上最重要的经济果树之一,据联合国粮食及农业组织统计,截止到2013年,中国葡萄栽培面积已达715.5万hm2,葡萄总产量超2 300万kg。长期以来,葡萄病害是影响葡萄产业健康发展的重要因素。近年来研究发现由葡萄座腔菌科真菌(Botryosphaeriaceae)引起的葡萄溃疡病(Botryosphaeria dieback)是葡萄上的主要枝干病     

河北省番茄黄化曲叶病毒病的分子鉴定初报

双生病毒是一类具有孪生颗粒形态的植物单链病毒,目前双生病毒病害已在多个国家和地区的作物上造成严重危害。近年来,我国多省报道作物上有这类病毒的发生,且有逐年加重和扩散的趋势。根据危害番茄的双生病毒DNA A序列保守区设计简并引物,对2009年4月采自河北省魏县表现叶片黄化、曲叶症状的4个番茄样品进行PCR检测,均为双生病毒阳性,对样品的扩增片断进行了克隆测序,经序列比对分析,与番茄黄化曲叶病毒（Tomato leaf curl virus,TYLCV）山东分离物（FJ646611.1）序列相似性为99.25%~99.55%,说明河北番茄黄化曲叶病由TYLCV引起。     

番茄黄化曲叶病毒的鉴定与群体进化分析

番茄黄化曲叶病(tomato yellow leaf curl disease,TYLCD)是番茄上的重要病害,可由多种双生病毒引起。为了明确北京地区番茄黄化曲叶病的病毒种类和病毒基因组变异情况,本研究收集了51个采自北京不同区县的病毒疑似样品,进行了双生病毒的检测及分离物的基因组分析。经双生病毒简并引物检测25个样品呈阳性;扩增获得10个代表性分离物的全基因组,大小均为2 781bp,共含有6个开放阅读框;经比对,10个分离物与Tomato yellow leaf curl virus-Israel(TYLCV-IL)同源率大于99%;基于我国TYLCV分离物全基因组序列的变异分析表明,TYLCV在进化上比较保守,整个基因组上的变异是不均匀的;系统发育树显示我国TYLCV分离物在进化树上可分为3个组群,分析了我国TYLCV群体进化情况。     

葡萄溃疡病菌转化子致病力快速评价体系的建立

为探索快速、稳定、高效的葡萄溃疡病菌转化子致病力评价方法,分别采用无伤接种、昆虫针针刺接种、打孔器打孔接种等3种接种方法,将随机选取的来自葡萄溃疡病菌REMI转化子库的50株转化子分别接种‘富士’苹果果实和‘夏黑’葡萄一年生绿枝条,测量病斑大小.结果表明,用葡萄绿枝条接种能区分不同转化子的致病力,而苹果果实则仅能将致病力减弱的转化子筛选出来.在葡萄绿枝条上致病力减弱的转化子有96.15％在‘富士’苹果果实上的致病力也是减弱的,而用苹果果实接种未筛选到致病力增强转化子.上述结果为获得致病力突变体奠定了基础.     

可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1信号肽的鉴定及其酶活性分析

为明确可可毛色二孢β-1,4-葡聚糖内切酶LtEg1是否能够分泌至胞外及其活性,采用酵母互补试验分析了内切酶LtEg1的信号肽活性,利用3,5-二硝基水杨酸法检测了内切酶LtEg1活性,通过实时荧光定量PCR测定了LtEg1基因在不同侵染阶段的表达量。内切酶LtEg1的信号肽和酵母蔗糖酶的融合表达能够引起酵母蔗糖酶的外泌,使得酵母转化子能够在以棉子糖为唯一碳源的培养基上生长。内切酶LtEg1能够以羧甲基纤维素钠为底物,发挥其酶活功能。与营养菌丝阶段相比,LtEg1基因在病原菌侵染阶段的表达水平显著升高;且在接种后48 h,LtEg1基因的表达量达到高峰,约为营养菌丝阶段的12倍,表明内切酶LtEg1作为重要的外泌蛋白酶,在可可毛色二孢侵染致病过程发挥了重要作用。     

国家葡萄产业技术体系与康奈尔大学的合作向实质推进

6月6日上午，北京市农林科学院一康奈尔大学葡萄病害研究联合实验室在国家葡萄产业技术体系病害防控岗位所在单位北京市农林科学院植保所正式挂牌。美国康奈尔大学终身教授、科技产业园主任RobertC．Seem博士、国家葡萄产业技术体系首席科学家段长青教授、北京市农林科学院院领导李云伏院长，院长助理王之岭，国际合作处王国进处长以及植保所的所领导、各研究室主任等参加了揭牌仪式。