镉对克氏原螯虾肝胰腺触角腺及鳃中SOD和CAT活性的影响

采用急性毒性实验方法,将克氏原螯虾分别暴露在浓度为7.5、10、15、30 mg·L-1的Cd2+溶液中96 h,实验期间对肝胰腺、触角腺、鳃等组织的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活力及随时间变化进行了检测.结果表明,在10 mg·L-1Cd2+胁迫下,肝胰腺和触角腺中SOD和CAT活力在胁迫初期急剧升高,72 h后降低并趋于稳定,而鳃中SOD和CAT两种酶的活力在96 h内变化不显著(P>0.05);当Cd2+度为30mg·L-1时,肝胰腺、触角腺和鳃中的SOD、CAT酶活力显著受到了抑制(P<0.05).通过比较发现,克氏原螯虾鳃中SOD和CAT活力要明显低于肝胰腺和触角腺中这两种酶的活力(P<0.05),并且肝胰腺和触角腺对Cd2+的应激反应要比鳃更为敏感.由以上结果可以看出,肝胰腺和触角腺中的抗氧化酶系统在Cd2+胁迫初期发挥了一定的抵御作用,而到后期抗氧化酶活性明显受到了抑制;另外低浓度的镉(7.5 mg·L-1)对肝胰腺和触角腺中的SOD和CAT酶活起到了激活作用,而高浓度的镉(30 mg·L-1)对3个组织中的抗氧化酶起到了明显的抑制作用.     

巴东木莲雌蕊柱头蛋白的提取与双向电泳分离

优化巴东木莲雌蕊柱头蛋白的提取方法,并用双向电泳方法分离提取蛋白,得到分辨率高和重复性较好的双向电泳图谱.在考马斯亮蓝R-250染色胶上,开花前柱头蛋白有858个蛋白点,开花后的聚合雌蕊柱头有865个蛋白点.有1个蛋白点只在开花前柱头蛋白中表达,3个蛋白点只在开花后的聚合雌蕊柱头中表达.为分析花粉和柱头间的识别奠定基础.     

巴东木莲DNA的提取及SRAP-PCR反应体系的正交优化止父优化

研究确定了提取巴东木莲基因组DNA的方法．采用正交试验设计法对影响SRAP—PCR反应的引物浓度、TaqDNA聚合酶的用量、Mg^2＋和dNTPs浓度及PCR扩增程序中的退火温度及循环次数进行了比较、优化,同时对DNA模板浓度进行了筛选。结果表明,Mg^2＋、dNTPs、砌酶及引物的不同水平均对PCR反应结果有显著的影响。建立了巴东木莲20μL SRAP—PCR的反应体系为1xbuffer、Mg^2＋浓度为2．0mmol&#183;L^-1、dNTPs浓度为0．25mmol&#183;L^-1、引物浓度为0．45μmol&#183;L^-2、Toq酶为O．5U和模板DNA40ng。适宜的扩增程序为94℃预变性1min,94℃变性1rain,33℃复性1min,72℃延伸1min,10个循环;94℃变性1min,55℃复性1min,72℃延伸1min,30个循环;最后72℃延伸5min。试验表明,该体系重复性好、稳定性强．     

濒危植物巴东木莲ISSR分子标记技术体系的建立

利用正交设计建立和优化适合于濒危植物巴东木莲的ISSR-PCR分子标记技术体系.对影响ISSR-PCR反应的多个因素,包括引物和DNA模板浓度、Taq酶用量、Mg2 和dNTPs浓度以及PCR扩增的退火温度、退火时间及循环次数等进行了优化.结果表明,适于巴东木莲ISSR-PCR反应的分子标记技术体系为:反应总体积20μ1,含2μ1 10×buffer、1μ1 20 mmol/L Mgcl2、4μ1 2 pxaoL/L引物、0.4μ1 10 mmoL/L dNTPs、0.8μ1 5 u/μ1Taq酶及40 ng模板DNA;PCR扩增程序为:94℃预变性5 min,94 oC变性30 8,54 oC复性45 s,72℃延伸1.5min,35个循环,最后72℃延伸7 min.本研究建立的ISSR分子标记技术体系稳定性强,重复性高.     

三个不同品系中华鳖形态差异分析

通过测量中华鳖(Pelodiscus sinensis)淮河品系(3龄)、黄河品系(8月龄)和日本品系(8月龄)的10项形态参数,对不同品系和性别的形态差异进行分析。主成分分析表明,3个品系4个主成分的累计贡献率为80.5%,其中第1主成分是中华鳖的体型因子,贡献率最大,3个品系的形态差异主要体现在体型上。通过逐步判别法建立了3个品系的判别函数,淮河、黄河和日本品系的判别准确率分别为91.7%、75.0%和73.8%,淮河鳖的形态与其他品系的中华鳖存在较大的差异。3个品系中不同性别的判别分析显示,淮河品系中华鳖雌雄判别准确率也较高,综合判别率为88.3%,判别效果最好,建立的判别函数可初步用于不同品系不同性别中华鳖的鉴定。中华鳖形态特征的差异分析为今后中华鳖种质资源鉴定和新品种(系)的选育提供了参考依据。     

黄颡鱼生长抑素基因的克隆及表达谱分析

【目的】克隆黄颡鱼生长抑素(Somatostatin,SS)基因cDNA全长序列,分析其在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各个组织中的表达规律。【方法】以黄颡鱼脑组织为材料,根据瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰SS基因保守区设计1对引物用于扩增SS基因中间保守区序列,再根据中间保守区序列设计2对引物,分别用于扩增5′端和3′端序列,将扩增得到的中间保守区序列、5′端和3′端序列拼接后得到黄颡鱼SS基因的cDNA全长序列,并对其进行生物信息学分析。用NCBI的Protein Blast对黄颡鱼与其他物种SS基因编码的氨基酸序列同源性进行比较,并构建系统发育树。用实时荧光定量RT-PCR检测SS基因在胚胎发育时期和胚后发育阶段（1～20 d）的表达特征。采用半定量RT-PCR检测SS基因在黄颡鱼脑、心脏、肌肉、胃、肝脏、肾脏、鳃、脾脏、性腺等组织中的表达特征。【结果】黄颡鱼SS基因cDNA全长694 bp,其中5′端非翻译区139 bp,3′端非翻译区211 bp,开放阅读框为345 bp,编码114个氨基酸。黄颡鱼与瓦氏黄颡鱼SS基因编码氨基酸同源性最高,为98%。系统发育树结果显示,黄颡鱼与同属于鲇形目的瓦氏黄颡鱼和斑点叉尾鮰聚为一支。SS基因在黄颡鱼受精卵时期就有表达,并持续至胚胎孵化出膜,且在心跳期和出膜期的表达量显著高于受精卵时期(P＜0.05);在出膜后的1～20 d,SS基因在黄颡鱼中稳定表达;在成鱼的各个组织中,SS基因只在脑组织中特异性表达。【结论】初步探明了SS基因在黄颡鱼胚胎发育、胚后发育阶段及成鱼各组织中的表达规律,推测其可能在黄颡鱼胚胎发育中发挥着重要的生理功能。     

基于mtDNA全序列的南方大口鲇进化分析

【目的】基于线粒体基因组(mtDNA)探讨南方大口鲇在鲇形目中的系统进化地位,为鲇形目鱼类的系统进化研究积累基础资料。【方法】采用参照近缘物种线粒体基因组设计覆盖全基因组引物的方法,设计合成16对引物对南方大口鲇mtDNA进行分段扩增,拼接后获得其mtDNA全序列,对其基因组结构进行初步分析,并基于mtDNA序列对南方大口鲇进行系统进化分析。【结果】南方大口鲇mtDNA全长16 527bp(GenBank检索号为:HM746661),包括2个rRNA基因、22个tRNA基因、13个编码蛋白质基因和1个非编码控制区;序列分析显示,南方大口鲇线粒体基因组结构和基因排列顺序与现已公布的鲇形目鱼类完全一致。系统进化分析表明,南方大口鲇与六须鯰聚为一支,黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼、光泽黄颡鱼和越南拟鲿聚为一支,湄公河巨鲶、长臀鮠及斑点叉尾鮰聚为一支,这3支聚在一起后再与牛头鲴及黑躯兵鲶相聚,最后与扬子鳄相聚。【结论】南方大口鲶与鲇形目鲇科鱼类六须鲶的进化地位最为相近。在进行系统发育研究时,应选择合适的基因,以便得到较为可靠的系统发育结果。     

珍稀濒危植物香果树RAPD反应条件的优化

以采自湖北省神农架地区的14株香果树Emmenopterys henryi为材料,提取其叶片基因组DNA,并以其基因组DNA为模板进行随机扩增多态性DNA(RAPD)反应条件的优化。RAPD反应条件中的各个因子,包括模板DNA质量浓度、引物浓度、dNTP浓度、DNA聚合酶浓度和Mg2 浓度。结果表明,香果树基因组DNA在以下条件有较好的扩增效果:25μL体系中,Taq酶1.33×10-3kat.L-1;随机引物0.5μmol.L-1;Mg2 2.6 mmol.L-1;dNTP 220μmol.L-1;DNA模板4.40 mg.L-1。聚合酶链式反应(PCR)程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,43℃退火1 min,72℃延伸2 min,经过40个循环,最后72℃延伸8 min。此体系和反应程序可获得比较稳定的扩增结果。图6表1参8     

CRP基因原核表达载体的构建和表达及其免疫原性检测

采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白。以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的CRP基因,将其克隆入表达载体pET28 a( )中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原性检测。成功地构建了CRP基因原核表达载体pET28 a( )-CRP,经IPTG诱导SDS-PAGE电泳分析表明C-反应蛋白能在大肠杆菌中获得表达,但免疫原性检测初步结果为阴性。结果证明CRP能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到大量表达,表达产物缺乏免疫原性,其机理还有待进一步试验探讨。     

珍稀植物香果树植株再生体系的建立

通过不定芽直接再生和经愈伤组织诱导器官发生两种途径,建立了香果树快速、高频率发生的植株再生体系,探讨了不同外植体（幼叶切块、茎段、叶柄和根）、叶片放置方式、植物生长调节剂和培养条件对不定芽直接再生和愈伤组织诱导器官发生的影响.香果树愈伤组织诱导器官发生结果表明:不同外植体在MS附加1.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L 2,4-D的培养基上愈伤组织诱导率均为100%,其中叶片外植体叶面向下放置效果最好;愈伤组织在MS添加0.5 mg/L 6-BA和0.5 mg/L NAA的培养基上不定芽的分化率为94.35%.香果树不定芽直接再生结果显示:叶片外植体在MS添加6-BA或ZT的培养基上,不定芽直接再生率均高达100%,其中在MS附加2.0 mg/L 6-BA培养基上,产生的不定芽数目多,生长旺盛;附加1.0 mg/L ZT 培养基上,不定芽数目多达56.67个/cm[[sup]]2[[/sup]],但生长较弱.黑暗预培养有利于香果树叶片外植体不定芽的再生.两种途径得到的不定芽转到1/2 MS培养基上均可生根,生根率达100%,附加1.0 mg/L 的IBA和0.5%的活性炭有利于再生植株根的生长.