牛卵形巴贝斯虫PCR检测方法的建立及初步应用

为建立牛卵形巴贝斯虫(B.ovata)快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的B.ovata CCTη基因序列设计引物,建立了PCR检测方法。对该方法的最佳反应条件进行优化,并进行特异性、敏感性及临床样本检测试验。结果表明,建立的PCR方法扩增B.ovata CCTη基因片段大小为1 008 bp,与参考株序列同源性为100%。该方法对牛巴贝斯虫、牛双芽巴贝斯虫、牛瑟氏泰勒虫基因组DNA扩增结果均为阴性。最低可以检测样品中34个拷贝的DNA。通过对49份临床样本的检测,该方法比姬姆萨染色镜检阳性率高8.2%。本实验为B.ovata的诊断提供了一种特异、敏感的检测技术。     

犬新孢子虫MAG1与IFN-γ融合基因重组真核质粒的真核共表达及免疫学评价

为对犬孢子虫MAG1与IFN-γ融合基因重组真核质粒进行免疫学评价,本实验以含有MAG1-IFN-γ基因片段的克隆质粒为模板,扩增MAG1-IFN-γ目的片段,构建pVAX-MAG1-IFN-γ重组真核表达质粒,将其转染Vero细胞,采用间接免疫荧光(IFA)和western blot技术检测MAG1基因在Vero细胞中的表达,并免疫BALB/c小鼠,进行免疫学评价。结果表明,PCR扩增获得基因片段大小为1 536 bp,与GenBank中登录的MAG1和IFN-γ核苷酸序列的同源性为99%;IFA检测MAG1基因在Vero细胞中获得瞬时表达,转染的Vero细胞呈现特异性绿色荧光;western blot分析表达蛋白的分子量为57 ku,具有较好的反应原性。将构建的重组真核表达质粒免疫BALB/c小鼠,经间接ELISA和T淋巴细胞亚群含量测定表明,重组质粒具有较好的免疫原性。本实验为新孢子虫病核酸疫苗的深入研究奠定了基础。     

猪附红细胞体对自然感染长白仔猪血液学指标的影响

为研究猪附红细胞体对自然感染长白仔猪血液学指标的影响,采用姬姆萨染色法和PCR方法对自然感染猪附红细胞体长白仔猪进行了病原体鉴定,采用全自动动物血液细胞分析仪对猪附红细胞体病长白仔猪的血液学指标和血清生化指标进行了检测。结果表明,自然感染猪附红细胞体长白仔猪的红细胞总数、红细胞压积、血红蛋白浓度降低,白细胞总数升高;谷丙转氨酶、谷草转氨酶、碱性磷酸酶等血清酶活性升高;尿素氮含量降低;血糖、总胆固醇等含量无明显变化。研究结果为猪附红细胞体病的临床诊断提供了理论依据。     

贝尼尔缓释剂的研制及其对牛瑟氏泰勒虫病的防治效果

选用β－环糊精制备了贝尼尔缓释剂。该制剂为细颗粒状悬浮液，颗粒大小为０．２～０．４μｍ，分布均匀，粘度小，流动性好，稳定性较好，便于肌肉注射。通过兔、牛体内的免疫学测定，证明该缓释剂的药物释放时间比对照水剂延长０．８～１倍。贝尼尔缓释剂对瑟氏泰勒虫感染的预防试验结果表明，按每公斤体重５ｍｇ的剂量一次肌注，无论对本地牛还是外地引进牛，在２个月的保护率均达１００％，染虫率仅为０．１％～１％，呈现一定水平的带虫现象，而对照贝尼尔水剂组的保护期仅为２０ｄ。在牛瑟氏泰勒虫病的早期（１０ｄ以内）使用该缓释剂进行治疗，治愈率可达１００％，区域试验结果也证明了这一点，但剂量要适当加大，按每公斤体重用药７～１０ｍｇ。     

牛瑟氏泰勒虫P23基因的克隆与生物信息学分析(英文)

[Objective] The aim of this study is to provide basis for developing genetic engineering vaccine and diagnostic kit for Theileria sergenti infection. [Objective] P23 gene of Theileria sergenti was amplified from its genomic DNA by PCR amplification, and cloned into the pGEM-Easy vector; then the sequencing result was analyzed with bioinformatics methods. [Result] Whole length of the P23 gene from Theileria sergenti is 684 bp containing a 672 bp open reading frame. The deduced amino acid sequence (223 amino acid residues) contains a signal peptide of 19 amino acid residues and two fragments of transmembrane domains, with relative molecular weight of the 25.886 kD and with the pI of 9.22. The homology between the yielded sequence and Chitose of Theileria sergenti P23 gene(TS-Chitose type, D84446), Ikeda of Theileria sergenti P23 gene(TS-Ikeda type, D84447) reached 99% and 90%, respectively. The sequence has been accessed in GenBank(EU573168). [Conclusion] The protein encoded by the P23 gene has better stability and immunogenicity, thus can be used as the antigen candidate for preparing genetic engineering vaccine for Theileria sergenti.     

以P33重组蛋白为诊断抗原建立牛瑟氏泰勒虫病乳胶凝集试验

本试验用P33重组蛋白建立了牛瑟氏泰勒虫病乳胶凝集试验。对81份被检血清的检测结果,阳性率为44.4%,明显高于血涂片镜检法的21.0%(P<0.01),而且在该病流行地区的不同牧场、不同性别和不同年龄牛的阳性率之间未见显著差异。试验表明,以P33重组蛋白作为诊断抗原具有特异性强、抗原易纯化和成本低等优点。     

小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P15基因的克隆和表达

通过PCR扩增出小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)P15基因片段。将该片段连接到克隆质粒裁体pUC19的BamH Ⅰ酶切位点上，并对其序列进行了测定。结果表明，该基因长度为479bp，编码的表面蛋白由148个氨基酸残基组成。再将P15蛋白基因片段分别在大肠杆菌和哺乳动物细胞中表达，经SDS-PAGE分析和Western blot检测，结果表明，小球隐孢子虫P15蛋白基因在大肠杆菌内获得表达的融合蛋白相对分子质量为50000；在哺乳动物细胞中，重组痘病毒表达的蛋白相对分子质量为18000-22000，与直接从自然感染牛小球隐孢子虫分离的P15蛋白的相对分子质量相似。     

贝尼尔缓释的研制及其对牛瑟氏泰勒虫病的防治效果

选用β－环糊精制备了贝尼尔缓释期,该制剂为细颗粒状悬浮液,颗粒大小为０．２～０．４μｍ分布均匀,粘度小,流动性好,稳定性较好,便于肌肉注射,通过兔,牛体内的免疫学测定,证明该缓释剂的药物释放时间比对照水剂延长０．８～１倍,贝尼尔缓释剂对瑟氏泰勒虫感染的预防试验结果表明,按每公斤体重５ｍｇ的剂量一次肌注,无论对本地牛还是外地引进牛,在２个月的保护率均达１００％,染虫率仅为０．１％～１％,呈现一定水平     

奶牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白基因的克隆及序列分析

研究根据GenBank上发表的牛瑟氏泰勒虫P33表面蛋白的基因序列设计合成1对引物,用PCR方法扩增出了牛瑟氏泰勒虫的基因片段,将该基因纯化后连接到pMDl8-T栽体上,进行序列测定和分析,并用此方法对延边某奶牛场10头奶牛进行了检测.结果表明:10份样品中9份为阳性,所扩增的目的基因核苷酸长为868 bp,共编码283个氨基酸;该段基因片段与牛泰勒虫韩国株核苷酸序列同源性为99.4%,氨基酸同源性为99.3%.     

猪附红细胞体病PCR诊断方法的建立

猪附红细胞体病是由猪附红细胞体(Eperythrozo on suis)寄生于猪红细胞表面或游离于血浆及骨髓中引起的,以仔猪发热、贫血、黄疸和母猪流产等症状为特征.传统的外周血液涂片检查方法常常受到血液里不明微生物、非病原性物质和染料颗粒等因素的干扰.血清学中的IHA试验、CFI或ELISA等方法的敏感性和特异性也存在一定局限性.