牛支原体疫苗的研究进展

牛支原体(Mycoplasma bovis,M.bovis)是一种造成全世界范围内育肥牛和奶牛多种疾病综合征的重要病原体。临床症状主要包括长期性肺炎及多发性关节炎(CPPS)、呼吸道疾病综合征(BRD)、乳腺炎及生殖器官疾病。牛支原体能感染多种组织和器官,也能从健康的牛体内分离,是威胁畜牧业生产的主要病原体。由于临床上抗生素治疗效果不佳,预防或控制牛支原体感染最好的选择是研发有效的商业可用的疫苗。牛支原体疫苗的研究已历经多年,虽然存在很多问题,但也取得了一定进展。文章对牛支原体弱毒疫苗、灭活疫苗及亚单位疫苗的研究进展进行了总结,并讨论了疫苗设计的优化方案,为合理设计和研发有效的牛支原体防控技术提供参考。     

胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及序列测定

用PCR法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)7型的DNA提取物中扩增出大小为2873bp的APXⅡA基因片段；将PCR产物重组到质粒载体pMD18-T中，并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明，克隆片段为完整的目的基因，该片段的核苷酸序列与国外分离株M30602的同源性达99．7％。     

牛支原体能量耦合因子转运蛋白S组件MbBioY摄取外源生物素的功能分析

牛支原体(M.bovis)感染与生存依赖于外界微环境提供的各类营养代谢因子。开展M.bovis外源生物素摄取的机制研究,将对M.bovis防控具有极其重要的意义。通过对M.bovis PG45 MbBioY(MBOVPG45＿0349)基因进行系统发育分析、分子对接分析,筛选M.bovis PG45 MbBioY突变株,比较PG45和PG45ΔMbBioY的生物素敏感性,异源构建MbBioY功能性克隆验证其功能。结果表明,PG45染色体上存在一种崭新的生物素膜转运蛋白,全长996 bp, GC含量30.95%,蛋白长度为332个氨基酸,是由7个跨膜结构域组成的能量偶合因子(ECF)转运蛋白S成分MbBioY。进一步验证后发现,当M.bovis缺失MbBioY会影响其生长,表现出生物素代谢营养缺陷的表型。通过异源敲入生物素代谢营养缺陷大肠杆菌MG1655,表明MbBioY单独存在时,就能够恢复生物素代谢营养缺陷大肠杆菌缺失株的生理功能。初步证明,MbBioY编码的是能量偶合因子(ECF)转运蛋白的S成分具有摄取外源生物素的能力,该研究结果将补充细菌生物素代谢调控的多样性和复杂性,为M.b...     

胸膜肺炎放线杆菌毒力因子重组蛋白免疫原性研究

【目的】研究猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(APP)重组亚单位疫苗的免疫保护效果。【方法】用1.0mmol/LIPTG诱导重组表达质粒pET-ApxⅠA、pET-ApxⅢA和pPRoAppOML-1,SDS-PAGE鉴定。纯化的表达产物通过Western blot分析有较好的免疫原性。将rApxⅠ、rApxⅢ和rOmp组合作为疫苗Ⅰ组,rApxⅠ、rApxⅢ、rOmp和灭活菌苗组合作为疫苗Ⅱ组,APP 1、3、7型菌制备的灭活疫苗作为疫苗Ⅲ组,PBSⅣ作为空白对照组,进行家兔的免疫试验。免疫共分2次,每次间隔2周。【结果】疫苗Ⅱ组的抗体水平均显著高于疫苗Ⅲ组,疫苗Ⅰ组抗体水平不如疫苗Ⅲ组,其血清效价最高滴度为1∶256。【结论】猪传染性胸膜肺炎毒力因子重组蛋白具有一定的免疫原性,为进一步研究新型亚单位疫苗奠定了基础。     

牛支原体08M株突变体文库的构建及鉴定

旨在使用转座子插入突变方法构建牛支原体08M株的突变体文库,为毒力相关基因的鉴定提供技术平台。测定了牛支原体08M株的浓度(颜色变化单位,CCU)和庆大霉素最低抑菌浓度(MIC)。应用电穿孔方法,将庆大霉素抗性质粒p ISM2062(携带有转座子Tn4001mod)导入牛支原体08M株感受态细胞内,经抗性平板筛选、液体培养及PCR鉴定,构建08M株的突变体文库。随机挑选10个克隆菌株传10代检测转座子稳定性,挑选2个克隆用Southern blot检测转座子是否存在多次插入。结果显示:08M株浓度为1.13×107CCU/m L,庆大霉素MIC为16 ng/μL;电转化p ISM2062的牛支原体08M株在抗性平板形成菌落445个,从中克隆培养成功380个,PCR鉴定结果显示存在Tn插入的菌株有263个,阳性率为69.21%(263/380);插入的转座子稳定传代,且无多次插入。本研究成功初步构建了牛支原体08M株的转座子插入突变体文库。     

应用双重PCR方法检测羊支原体肺炎病原

通过对丝状支原体山羊亚种(M.mycoides subsp.capri,Mmc)特异性引物MmcF/MmcR和绵羊肺炎支原体(M.ovipneumontiae,Mo)特异性引物LmF/LmR退火温度、引物浓度比例等条件的选择,建立了一个可以同时检测Mmc和Mo的双重PCR方法。该方法可同时扩增出Mmc 195 bp和Mo 361 bp目的片段,但对其他病原菌不能扩增出任何条带,具有良好的特异性。敏感性试验表明,该方法能够分别检测出0.1ng的Mmc DNA和0.01 ng的Mo DNA,或同时检测出1ng Mmc和1ng Mo混合的DNA。用该双重PCR方法可对实验室保存的4株绵羊肺炎支原体和2株丝状支原体山羊亚种进行准确鉴定,并可从临床病料中检测出相应支原体,表明建立的双重PCR方法可用于Mmc和Mo的快速鉴定、实验室诊断和病原学调查。     

丝状支原体山羊亚种抗体间接血凝检测方法的建立及应用

将丝状支原体山羊亚种PG3株经超声波破碎处理后的产物致敏经戊二醛和鞣酸处理过的绵羊红细胞,建立了检测丝状支原体山羊亚种抗体的间接血凝试验方法。抗原致敏红细胞的最佳浓度是100～125μg/mL,超免血清抗体效价达1:512～1:1024。免疫山羊2周后血清抗体检出率为83.3%,对羊布氏杆菌、绵羊肺炎支原体阳性血清检测均为阴性,敏感性明显高于琼脂扩散试验。对628份田间血清进行检测,阳性率为44.9%。结果表明,该法敏感性较高、特异性强和重复性好,可用于山羊传染性胸膜肺炎免疫抗体水平的监测和流行病学调查。     

猪胸膜肺炎放线杆菌外膜脂蛋白基因的克隆及序列分析

以国内主要流行的猪胸膜肺炎放线杆菌(APP)QH-1、HN-7菌株的基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增出外膜脂蛋白(OML)基因片段，然后将其克隆至pMD18-T载体中，经酶切和PCR鉴定，对阳性克隆进行序列测定。将测序结果分别与标准菌株进行比较，QH—1株的核苷酸序列与血清1、9、11、12型参考株的同源性达99．1％～99．9％；HN-7株的核苷酸序列与血清7、3、4、6型参考株的同源性达97．3％～100％，与其他血清型参考株的同源性较低。     

4种抗原定量方法观察牛支原体培养特征

为探索在疫苗研制过程中牛支原体抗原收获时间及抗原定量替代方法,将牛支原体08M株接种于含10%马血清的Thiaucourt's培养基,在110 h内同时监测其颜色变化单位（color change units,CCU）、菌落形成单位（colony forming units,CFU）、菌体蛋白浓度和核酸含量的变化,绘制相应曲线。活菌计数结果（CCU和CFU）显示,牛支原体生长可分为明显的4期,10 h进入对数期,30 h进入稳定期,活菌数最高可达1.0×10⁸ CCU/mL和7.7×10⁷ CFU/mL,75 h进入衰亡期;蛋白浓度从15 h开始迅速增长,至35 h蛋白浓度最高,为72.06 μg/mL,此后维持在58.38~70.65 μg/mL;核酸含量从15 h开始增长,至25 h后Ct值维持在15.32~17.84。结果表明,牛支原体蛋白含量在稳定期初期与活菌数具有良好的相关性。因此,在牛支原体灭活疫苗生产中,稳定期初期是最佳抗原收获时间,可用蛋白浓度法代替活菌计数法进行抗原定量。     

几种中药成分的免疫增强活性及其作用效果

测定了黄芪多糖等9种中药成分对正常小鼠脾和外周血淋巴细胞增殖反应的影响，并观察了这些中药成分对兔瘟组织灭活疫苗的增强免疫效果。结果表明，人参皂甙、黄芪多糖、淫羊藿多糖、当归多糖和蜂胶黄酮能显著增强伴刀豆球蛋白(ConA)和脂多糖(LPS)诱导的小鼠淋巴细胞增殖，提高免疫兔抗体水平和延长抗体持续时间；板蓝根多糖能增强ConA和LPS的诱导活性，蜂胶多糖能促进ConA的诱导活性，黄芪皂甙和淫羊藿黄酮能促进LPS诱导的淋巴细胞增殖，但它们都不能提高兔瘟组织灭活疫苗的免疫抗体水平。