牛支原体黏附宿主细胞间接免疫荧光检测方法的建立

牛支原体可引起牛肺炎、乳腺炎和关节炎等多系统炎症,关于其黏附宿主细胞的机理有待深入研究。本试验以牛支原体08M株和牛肾细胞MDBK为研究对象,抗牛支原体多克隆抗体为一抗,FITC标记的兔抗牛IgG为二抗,通过优化牛支原体黏附滴度、黏附时间及一抗、二抗工作浓度,建立牛支原体黏附宿主细胞的间接免疫荧光检测方法。最终确定牛支原体的最适黏附滴度为1×109 CFU/mL,黏附时间为4h,一抗最适工作浓度为1∶250,二抗最适工作浓度为1∶250。本试验建立的间接免疫荧光方法可用于牛支原体黏附宿主细胞的检测,为牛支原体体外感染的检测及黏附机理的研究提供有效的技术手段。     

哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术研究进展

随着生物制品行业的快速发展,哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术已经运用到越来越多的领域中。该技术能够扩大哺乳动物细胞培养的规模,提高生物制品的产量及质量,拓宽哺乳动物细胞的应用领域,并促进哺乳动物细胞生产实现工业化与产业化。但悬浮驯化后的细胞,与父母代细胞相比,蛋白表达水平与生长调节通路均发生了不同程度的改变,使其生产性能受到影响。对此,国内外学者开展了大量的研究并取得了较好进展。作者阐述了哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术的研究现状以及临床生产工艺的优化策略,以期为哺乳动物细胞无血清全悬浮培养技术的发展提供参考。     

牛支原体致病机理的研究进展

正支原体(Mycoplasma)是最小、最简单的能够自我复制的原核生物,在自然界中分布广泛,其中一些种属是许多动物、植物以及人类的病原体~[1]。支原体是由有细胞壁的细菌(更确切地说是真细菌中的革兰氏阳性菌)进化而来。至今被确定的支原体已超过200种,至少有20种可以感染牛~[2]。牛支原体是能够感染牛的一种非常重要的病原体,1961年在美国首次被分离~[3]。相较于其它支原体,牛支原体具有很高的宿主特异性,目前在养殖牛、北美野牛     

牛支原体中国株的多位点序列分型

为了解中国牛支原体的流行趋势,本试验应用已经建立的牛支原体分型方法,将中国的15株牛支原体进行MLST分型,同时结合数据库中已有的11株中国株的ST型,分析牛支原体中国株的种群结构及进化关系。分型结果显示,15株分离株均获得一样的等位基因号及ST型;共计26株中国株分属于3个ST型,即R-ST10(16/26),RST33(9/26),R-ST34(1/26),而且彼此之间只有1个等位基因的差异,10型和33型之间的差异是rpoD基因,33型和34型之间的差异是danA基因;说明目前牛支原体中国株的种群结构相对单一,流行菌株相对稳定。     

牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒四重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

利用多重荧光定量RT-PCR （real-time RT-PCR）方法,提高对多病原检测的速度和灵敏度,促进对犊牛腹泻的快速诊断和及时治疗。分别在牛星状病毒（BAstV）ORF2基因,牛病毒性腹泻病毒1型（BVDV-1）5'端非编码区,牛冠状病毒（BCV）N pro基因和牛轮状病毒（BRV）VP6基因的保守基因序列设计、合成并试验筛选了四对有效的特异性引物和探针。进一步利用含4种病毒目的片段的重组质粒,对引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,建立了Real-time RT-PCR标准曲线,并对四重Real-time PCR方法的特异性、敏感性、重复性和各种临床样本的适用性进行了评价。结果显示：Real-time RT-PCR最适退火温度和时间分别为50.0℃和45 s,BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的引物浓度分别为300、300、400和500 nmol·L^-1,探针浓度分别为250、150、100和300 nmol·L^-1。对BVDV-1、BCV和BRV的最低检测限均为10²copies·μL^-1,对BAstV的最低检测限为10³ copies·μL^-1,具有良好的特异性和重复性。该方法对临床采集的粪样的阳性检出率高于PCR方法。上述结果表明,建立的四重Real-time RT-PCR方法可以用于犊牛腹泻常见病原BAstV、BVDV-1、BCV和BRV的快速鉴别诊断。     

牛支原体08M株突变体文库的构建及鉴定

旨在使用转座子插入突变方法构建牛支原体08M株的突变体文库,为毒力相关基因的鉴定提供技术平台。测定了牛支原体08M株的浓度(颜色变化单位,CCU)和庆大霉素最低抑菌浓度(MIC)。应用电穿孔方法,将庆大霉素抗性质粒p ISM2062(携带有转座子Tn4001mod)导入牛支原体08M株感受态细胞内,经抗性平板筛选、液体培养及PCR鉴定,构建08M株的突变体文库。随机挑选10个克隆菌株传10代检测转座子稳定性,挑选2个克隆用Southern blot检测转座子是否存在多次插入。结果显示:08M株浓度为1.13×107CCU/m L,庆大霉素MIC为16 ng/μL;电转化p ISM2062的牛支原体08M株在抗性平板形成菌落445个,从中克隆培养成功380个,PCR鉴定结果显示存在Tn插入的菌株有263个,阳性率为69.21%(263/380);插入的转座子稳定传代,且无多次插入。本研究成功初步构建了牛支原体08M株的转座子插入突变体文库。     

4种抗原定量方法观察牛支原体培养特征

为探索在疫苗研制过程中牛支原体抗原收获时间及抗原定量替代方法,将牛支原体08M株接种于含10%马血清的Thiaucourt's培养基,在110 h内同时监测其颜色变化单位（color change units,CCU）、菌落形成单位（colony forming units,CFU）、菌体蛋白浓度和核酸含量的变化,绘制相应曲线。活菌计数结果（CCU和CFU）显示,牛支原体生长可分为明显的4期,10 h进入对数期,30 h进入稳定期,活菌数最高可达1.0×10⁸ CCU/mL和7.7×10⁷ CFU/mL,75 h进入衰亡期;蛋白浓度从15 h开始迅速增长,至35 h蛋白浓度最高,为72.06 μg/mL,此后维持在58.38~70.65 μg/mL;核酸含量从15 h开始增长,至25 h后Ct值维持在15.32~17.84。结果表明,牛支原体蛋白含量在稳定期初期与活菌数具有良好的相关性。因此,在牛支原体灭活疫苗生产中,稳定期初期是最佳抗原收获时间,可用蛋白浓度法代替活菌计数法进行抗原定量。