H9N2禽流感病毒HA全长基因的高效可溶表达及免疫原性研究

采用RT-PCR方法扩增了H9N2亚型禽流感病毒（AIV）广东株的血凝素基因HA．将HA基因克隆到笔者所设计的原核表达载体pMBX上，成功构建重组表达质粒pMBX-HA．将其转化到E.coli BL-21感受态细胞中表达，经SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为96200的融合蛋白，表达产物占菌体总蛋白的29．5％．经蛋白可溶性分析看出，融合蛋白90％以上是以可溶形式表达的．Western-blot证实，可溶表达的融合蛋白与H9N2 AIV阳性血清具有良好的免疫反应性．将可溶表达的融合蛋白用体积分数为50％的Ni-NTA树脂过柱纯化，用融合蛋白作抗原，通过ELISA方法，能特异性地检测出禽流感阳性血清．     

猪流行性腹泻病毒抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

【目的】建立2种猪流行性腹泻病毒(PEDV)抗体间接ELISA检测方法.【方法】分别以GD-1株PEDV灭活全病毒和原核表达的COE融合蛋白作为包被抗原,确定最佳ELISA条件,检验其重复性、特异性等,并进行临床应用.【结果和结论】确定了2种ELISA方法的最佳条件,重复性试验显示变异系数分别小于4.60%和5.30%,特异性试验检测口蹄疫病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清均为阴性,并具有良好的稳定性和较长的保存期.临床样品检测结果显示,223份血清样品总阳性率分别为97.3%(217/223)和98.6%(220/223),2种方法检测的阳性率相近,具有良好的检出率和很高的符合率,为PEDV的抗体检测及流行病学调查提供了一种技术手段.     

高致病性猪蓝耳病综合防控体会

2007年农业部证实高致病性猪蓝耳病是由猪繁殖与呼吸综合症病毒变异株引起、多种病原混合感染的一种急性高致病性疫病,又称"猪高热病"。本文从发病原因、流行病学分析、临床症状、剖检变化和综合防控措施等方面进行了综述。     

3株PRRSV变异株理化特性研究及NSP2、ORF5基因序列分析

用Marc-145细胞从广东省3个发病猪群分离到3株病毒,经RT-PCR方法鉴定为PRRSV变异株(NSP21594～1680bp缺失)。3株分离株第1代均对Marc-145细胞适应性不强,第2代可致典型病变,第3代TCID50分别为103.67、104.20、104.75mL-1;在透射电镜下观察主要为40～70nm大小的圆形、椭圆形具有囊膜的病毒粒子;均对氯仿、酸、碱和热敏感。3株分离株NSP2基因与CH-1a、VR-2332等经典PRRSV相比均存在2个位点30个氨基酸缺失,与JXA1、HUN4、HPDEBV等变异株具有相同缺失特性且高度相似,相似性为98.1%～98.3%。ORF5基因均由200个氨基酸组成,与JX-A1、HUN4、HPDEBV等变异株高度相似,相似性为98.5%～99.0%,且第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R)。本研究进一步证实在广东省内出现以NSP2缺失30个氨基酸为特征PRRSV变异株的流行,也为科学监测和综合防控该毒株感染引起的PRRS奠定了基础。     

类胡萝卜素的吸收代谢及其功能的研究进展

本文综述了类胡萝卜素在肠道的消化吸收和代谢转运、类胡萝卜素的抗氧化和免疫调节作用及其在基因表达调控中的重要作用、母源类胡萝h素在胚胎发育的作用及类胡萝卜素相关代谢基因在卵巢中的表达.类胡萝卜素的吸收机理以及生理功能的深入研究对人类健康、其在畜牧业中的应用以及功能性食品的生产具有重要作用.     

基因工程表达囊素生物活性的测定

为研究基因工程表达囊素(BS)生物活性,分别用9只豚鼠和160只10日龄试验鸡进行试验。豚鼠在腹腔注射合成BS和表达BS后,用MTT比色法检测T和B淋巴细胞的转化率。试验鸡用IBD活苗点眼免疫的同时皮下注射合成BS和表达BS,在免疫后0d、7d、14d、21d和28d每组随机选5只鸡采血分离血清后,剖杀计算脾脏指数、法氏囊指数。结果表明:①表达BS对T细胞增殖的刺激率增加17.22%,对B细胞增殖的刺激率增加10.06%;合成BS对T细胞增殖的刺激率增加18.88%,对B细胞增殖的刺激率增加13.66%,说明表达BS与合成BS均可提高T和B淋巴细胞对丝裂原刺激的反应性。②合成BS和表达BS组试验鸡的法氏囊指数明显高于对照组,这说明合成BS和表达BS对于IBD弱毒疫苗损伤法氏囊有一定的保护作用及在损伤后法氏囊的再生有促进作用。③合成BS组和表达BS组的IBDV抗体上升较对照组有上升趋势,但它们之间的差异不显著。     

猪圆环病毒的致病机理及其影响因素

猪圆环病毒2型(PCV2)感染可损伤猪的免疫系统,引起感染猪的胸腺萎缩、T细胞和B细胞数量减少;细胞因子的表达量改变,如IL-10的量上升,IL-8的量明显下降,IFN-γ量减少。同时,PCV2感染的靶细胞在胎儿期是心肌细胞、肝细胞和巨噬细胞,而出生后只有巨噬细胞。因而推测猪感染PCV后,机体的免疫力下降,感染猪处于亚健康状态,其它病原因子如猪繁殖与呼吸综合征病毒、细小病毒、衣原体、猪流感、肺炎支原体和胸膜肺炎放线杆菌等,或应激因素如营养元素缺乏、免疫刺激和较差的饲养管理等多种因素都可加重PCV2感染猪的病情,进而发展成临床症状和病理变化较明显的断奶后仔猪多系统综合征、猪肾病综合征等与猪圆环病毒相关痰病。     

胡须鸡β-防御素Gal-1-Gal-13基因克隆、序列分析及其在组织中分布

用设计的特异性引物,采用RT-PCR技术扩增到胡须鸡β-防御素基因Gallinacin-1(Gal-1)～Gallinacin-13(Gal-13)共13个基因编码区全长片段.通过克隆、测序获得13个基因的cDNA核苷酸序列,GenBank登陆号为:DQ858311～DQ858323.比较分析胡须鸡13种β-防御素Gal-1(a)～Gal-13,Gal-1基因与GenBank中注册的防御素基因氨基酸序列的同源性.均在96.5%～100%之间.利用Clustax软件对所获得的13种胡须鸡β-防御素基因进行系统发育树分析,结果显示Gal-1、Gal-1(a)、Gal-2、Gal-3、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7、Gal-8、Gal-12和Gal-13在同一大的分支上;Gal-9和Gal-10在同一分支;Gal-11独在一分支上.用RT-PCR方法分析胡须鸡β-防御素Gal-1～Gal-13基因在不同组织中的分布,结果发现:Gal-1、Gal-2、Gal-4、Gal-5、Gal-6、Gal-7和Gal-10的表达分布非常广泛,Gal-3、Gal-8、Gal-9、Gal-11、Gal-12和Gal-13的分布少.     

MicroRNA-1285及其靶标DDX3X对猪塞内卡病毒感染PK-15细胞的调控作用

【目的】探究MicroRNA-1285(miR-1285)及其靶标DDX3X在猪塞内卡病毒(Senecavirus A,SVA)感染PK-15细胞中的调控作用。【方法】利用qRT-PCR、双荧光素酶活性及Western blot等方法研究miR-1285和DDX3X对I型干扰素(IFN-β)分泌及RIG-I信号通路的作用,分析miR-1285及DDX3X对SVA 3C蛋白基因表达的影响。【结果】SVA感染PK-15细胞后,miR-1285表达量显著升高,并且miR-1285与DDX3X存在负靶向关系,二者可促进IFN-β转录及蛋白水平的表达。miR-1285通过靶向DDX3X对RIG-I信号通中的MAVS、TRAF3信号分子起调控作用。对于SVA 3C蛋白基因,DDX3X可以显著抑制其转录,并且可以逆转miR-1285所诱导的上调趋势。【结论】SVA感染PK-15细胞后,宿主miR-1285及其靶标DDX3X对IFN-β及病毒3C蛋白的表达具有调控作用,研究结果将为明确miRNAs调控SVA感染的分子机制奠定基础,并为SVA的防控和诊断提供新的科学依据。     

鸡β-防御素-1基因(Gal-1)在大肠杆菌中的融合表达与纯化

内源性抗菌多肽防御素是机体先天性免疫系统的重要组成部分，可帮助机体防御外界病原微生物的入侵。鸡β防御素-1（Gallinaein-1，Gal-1）对许多致病菌都具有杀菌作用，具有很好的研究开发价值。本研究利用PCR技术从重组质粒pGEM-TEasy-gal-1中克隆出Gal-1基因成熟肽区，将该基因插入原核表达载体pET-32a（＋）中，构建重组质粒pET-32a（＋）-gal-1，然后用重组质粒转化大肠杆菌BL-21。挑选阳性克隆菌，用浓度为0．5mmol／L的IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE电泳显示在目标位置约25kD处出现了条带并用Werstern Blot进行了鉴定。表明Gal-1基因在大肠杆菌以融合形式得到了表达。经灰度扫描显示重组蛋白表达量占细菌总蛋白的15．54％。用50％Ni-NTA纯化树脂进行层析纯化，在洗脱液E中出现单一条带。Gal-1多肽在pET-32a（＋）质粒表达体系中成功表达为鸡防御素多肽下一步的研究奠定基础。