巴西橡胶树HbMCSl基因的克隆及表达分析

2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环化磷酸合成酶(2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphat synthase,MCS)是异戊烯基焦磷酸合成途径之一.甲基赤藓糖磷酸(methylerythritol phosphate,MEP)途径中的第5个酶.催化2-磷酸-4-(胞苷-5'-二磷酸)-2-C-甲基-D-赤藓糖醇生成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2-4-环化磷酸.根据植物MCS的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树(Hevea brasiliensis)中获得了与其相应的MCS基因,命名为HbMCSl(GenBank登录号:FJl96164).序列分析表明HbMCSI长965 bp,编码241个氨基酸,该氨基酸序列与长春花(Catharanthus roseus)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryza sativa)、银杏(Ginkgo biloba)和三尖杉(Cephalotaxus fortunei)的MCS同源性分别达到70.8%、69.4%、64.9%和63.3%和62.2%.半定量RT-PCR结果显示,割胶诱导胶乳HbMCSI的表达,乙烯对HbMCSI的表达几乎没有影响;HbMCSI的表达具有组织差异性,在愈伤组织中大量表达,在叶片和胶乳中微量表达.     

巴西橡胶树HbNAC55的克隆及表达分析

在前期巴西橡胶树胶乳转录组测序的基础上,利用q RT-PCR技术,从巴西橡胶树中克隆得到1个NAC转录因子基因,命名为Hb NAC55。Hb NAC55全长1 755 bp,该基因编码584个氨基酸,蛋白质分子量为65.06 ku,等电点为4.79。蛋白结构分析发现,该蛋白含有一个NAM结构域,具有典型的NAC类蛋白的结构特征,与木薯、胡杨、可可、土瓶草、梅、胡桃、甜橙等物种的NAC家族成员具有较高的同源性,分别为81%、61%、56%、57%、55%和53%。通过q RT-PCR发现Hb NAC55在橡胶树胶乳中表达量最高。茉莉酸和乙烯均能诱导胶乳中Hb NAC55表达上调,其中茉莉酸甲酯处理12 h后Hb NAC55表达量提高了近6倍,乙烯处理48 h后HNAC55表达量提高了近1.7倍。本研究将为进一步研究Hb NAC55在巴西橡胶树中的功能提供了帮助。     

巴西橡胶树小橡胶粒子蛋白基因5'调控序列的克隆及功能初步鉴定

法尼基焦磷酸合酶是异戊二烯生物合成途径中的一个关键酶,根据NCBI数据库中巴西橡胶树法尼基焦磷酸合酶基因HbFPS序列设计引物,克隆了HbFPS起始密码子上游1066bp的5'调控序列。序列分析表明,该序列A/T含量为77.39%,含有典型的真核生物核心启动子区域,在该序列中发现了一些与真核生物典型的顺式调控元件相似的TATA-box、增强子元件、CAAT-box和GATA-box以及一些与激素、胁迫诱导、转录因子相关的顺式作用元件。构建了含有该序列的植物表达载体并转化烟草,对获得的转基因烟草T0代植株GUS染色发现转基因植株呈现蓝色,表明HbFPS的5'调控序列可以驱动GUS基因的表达,具有启动子的活性。     

巴西橡胶树乳管细胞HbSKP1基因克隆及原核表达

SKP1蛋白是茉莉酸信号途径关键环节之一的SCFCOI1复合体的成员,在CUL1和COI1之间起连接作用。本文采用RT-PCR和RACE技术,从巴西橡胶树无性系热研7-33-97的胶乳中克隆了HbSKP1基因。该基因全长778bp,含一个543bp的开放阅读框,编码180个氨基酸。生物信息学分析表明,推导的HbSKP1氨基酸序列含有SKP1家族特征性的Skp1-POZ和Skp1结构域。HbSKP1与蓖麻、毛果杨、拟南芥、油棕、啤酒花、苜蓿的SKP1类蛋白的氨基酸序列同源性分别为64%、61%、47%、47%、47%和47%。原核表达了HbSKP1-His(6)融合蛋白。本研究为进一步鉴定乳管细胞中茉莉酸途径核心环节SCFCOI1复合体打下良好基础。     

腰果CBF基因家族的鉴定及响应冷胁迫的表达模式

腰果（Anacardium occidentalie Linn）属于典型的热带果树,主要在我国的云南省、海南省等地种植。腰果具有重要的经济价值、社会价值、生态价值,为农民增产创收,实现共同富裕和乡村振兴战略具有重要价值。腰果对于低温十分敏感,在8℃时就会受到严重伤害,生长停止。所以低温胁迫是制约腰果生长的重要非生物胁迫。CBF转录因子是植物在应对低温、干旱、盐等非生物胁迫下中发挥重要作用的转录因子。然而CBF基因家族在腰果中的作用尚未阐明,该家族在低温胁迫下的表达模式尚不清楚。本研究对腰果AoCBF基因家族的基本特性进行探究,通过生物信息学方法,在腰果转录组中鉴定并获得6个AoCBF基因家族成员,分别对其系统发育、理化性质、蛋白结构、低温诱导下表达模式和启动子作用元件进行分析。理化性质分析结果表明：6个AoCBF蛋白长度为189～334 aa,蛋白分子量为21.31～37.89 kDa,等电点均小于7,表明该蛋白呈酸性,且均包含AP2/ERF结构域。基序分析表明：AoCBF基因存在5个基序,不同AoCBF基因Motif的缺失暗示着相关功能的缺失性。系统发育树分析表明：6个AoCBFs可...     

巴西橡胶树HbMET的克隆与表达分析

通过同源克隆和RACE方法获得了巴西橡胶树DNA甲基转移酶(DNA Methyltransferase,MET)基因(Hb MET)。Hb MET长4 896 bp,含有4 635 bp的阅读框架,编码1 545个氨基酸。蛋白分子量174.36 ku,等电点为6.36。氨基酸序列与可可、毛果杨、黄瓜、拟南芥、碧桃、葡萄和烟草等物种的MET家族成员的同源性分别为73%、77%、74%、56%、72%和68%。进化树分析表明,Hb MET氨基酸序列与毛果杨的MET亲缘关系最近。Hb MET在巴西橡胶树的根、树皮、叶、胶乳中均有表达,其中在胶乳中表达量最低;Hb MET在橡胶树自根幼态无性系的胶乳中表达比老态无性系胶乳中的表达低。     

海南龙血树DcbHLH1的克隆与表达分析

碱性螺旋-环-螺旋(basic/helix-loop-helix,bHLH)转录因子在真核生物的生长发育过程中起着重要的调控作用。在前期龙血树转录组测序结果基础上克隆了1个海南龙血树bHLH转录因子基因,命名为DcbHLH1。序列分析显示,DcbHLH1阅读框基因序列长1 080 bp,编码360个氨基酸,推测分子量为39 ku,等电点为8.21。氨基酸序列比对结果显示,DcbHLH1具有bHLH转录因子家族保守的HLH结构域。进化分析结果表明,DcbHLH1和中粒咖啡中的bHLH亲缘关系最近。定量PCR结果表明,DcbHLH1在诱导剂处理后3 d内表达量快速下降,到第6天达到最低,与转录组测序的数字表达谱一致。DcbHLH1在海南龙血树的根、茎、叶等组织中均有表达,但在叶中表达量较高,根中表达量最低。结果为进一步分析DcbHLH1在龙血树中的功能奠定了基础。     

巴西橡胶树半胱氨酸蛋白酶基因（HbCP1）的原核表达分析

为研究巴西橡胶树半胱氨酸蛋白酶生物学功能,利用笔者从橡胶树中克隆的半胱氨酸蛋白酶基因(HbCPI)(GenBank登录号:DQ642886)序列,构建了HbCP1基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达.结果表明,HbCP1基因在大肠杆菌中的表达产物具有生理毒性,抑制大肠杆菌的生长,初步确认RTX结构域是导致HbCPI表达产物具有生理毒性的原因.     

甘薯多酚氧化酶保守区的cDNA克隆及序列分析

多酚氧化酶是植物体内广泛存在的铜结合酶,催化一元酚或多元酚氧化生成“黑色素”,是引起果蔬等农产品褐变的主要原因。通过对已克隆的植物多酚氧化酶基因的分析,设计了一对简并引物,ＰＣＲ扩增了甘薯多酚氧化酶保守区的ｃＤＮＡ,序列分析结果表明,该ｃＤＮＡ含有５９１个核苷酸,编码１９７个氨基酸,与已发表的其它植物的多酚氧化酶保守区的ｃＤＮＡ具有很高的同源性。     

烟草伤诱导型过氧化物酶基因(tpoxN1)启动子的克隆及分析

利用GenomeWalker的方法获得了烟草伤诱导过氧化物酶基因(tpoxN1)的5’调控序列,序列分析表明,烟草的tpoxN1基因的转录起始位点(tspA)的保守序列5’TCAATCA与其它植物基因非常一致,转录从tsp下游79bp处开始。在邻近5’区域,发现下列5个真核生物顺式调控元件:在-28bp处存在TATAbox序列(TATAAATATGT);在-66bp处具有TCCAAT序列,与众多高等真核生物的启动子的‘CAAT’相似;在-204,-749处发现有TCA-like序列;在-840处存在GC-box;在-1005处存在CCAAT-box。