巴西橡胶树HbMCS1基因的克隆及表达分析

2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环化磷酸合成酶（2C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase,MCS）是异戊烯基焦磷酸合成途径之一——甲基赤藓糖磷酸（methylerythritol phosphate,MEP）途径中的第五个酶,催化2-磷酸-4- (胞苷-5’-二磷酸)- 2-C-甲基-D-赤藓糖醇生成2-C-甲基-D-赤藓糖醇-2-4-环化磷酸。根据植物MCS的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树中获得了与其相应的MCS基因,命名为HbMCS1。序列分析表明HbMCS1长965bp,编码241个氨基酸,该氨基酸序列与长春花、拟南芥、水稻、银杏和三尖杉的MCS同源性分别达到70.8%、69.4%、64.9%和63.3%和62.2%。半定量RT-PCR结果显示,伤害诱导胶乳HbMCS1的表达,乙烯对HbMCS1的表达几乎没有影响;HbMCS1的表达具有组织差异性,在愈伤组织中大量表达,在叶片和胶乳中微量表达。HbMCS1的克隆和表达分析为了解MEP途径在橡胶树胶乳中的作用和对天然橡胶生物合成的调控作用打下了基础。     

巴西橡胶树4－羟基－3－甲基－2-（E）－丁烯基－4－磷酸还原酶基因（Hb—HDR）的克隆及表达分析

4-羟基-3-甲基-2-（E）-丁烯基-4-磷酸还原酶（4-hydroxy-3-methyl-2-（E）-butenyl-4-diphosphate reductase,HDR）是异戊烯基焦磷酸合成途径之一甲基赤藓糖磷酸（methylerythritol phosphate,MEP）途径中的最后一个酶,催化4-羟基-3-甲基-（2E）-丁烯基-4-磷酸生成异戊烯基焦磷酸。根据植物HDR的同源序列设计引物,通过RT-PCR结合RACE的方法在橡胶树中获得了与其相应的HDR基因,命名为HbHDR。序列分析表明HbHDR长1627bp,编码462个氨基酸,属于LYTB家族,该氨基酸序列与烟草、长春花、胡黄连、拟南芥、银杏和火炬松的HDR同源性为79．1％、78．4％、76．5％、75．3％、72．2％和70．9％。半定量RT-PCR结果显示,乙烯诱导胶乳HbHDR的表达。     

齿肋赤藓乙醛脱氢酶基因ALDH21的克隆与表达分析

本文采用RT-PCR方法,从齿肋赤藓（Syntrichia caninervis）总RNA中获得ALDH21基因cDNA序列,连接到pMD19-T载体上并转化E.coli DH5α,阳性克隆经PCR鉴定后测序,将测序结果与GenBank中山墙藓（Tortula ruralis）和小立碗藓（Physcomitrella patens）相关基因序列进行同源性比对。结果表明,实验成功克隆了S.caninervis的ALDH21基因的cDNA序列（GenBank登录号：GQ245973）,为一个完整的ORF,其长度为1452bp。该序列与T.ruralis和P.patens的cDNA序列同源性分别为98%和78%,推导的氨基酸同源性分别为97%和87%。生物信息学分析表明该蛋白质分子量为52.98kD,等电点pI为5.96,编码483个氨基酸,具备ALDH21蛋白家族特征;半定量RT-PCR结果表明：ALDH21在干旱胁迫状态时的表达量显著高于水合状态,说明ALDH21基因可能参与干旱胁迫应答。本文为进一步研究齿肋赤藓ALDH21基因的抗旱机理提供理论依据。     

烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶基因(dxr)的克隆和表达分析

以烟草(Nicotiana tabacum)栽培品种K326为材料,采用RT-PCR技术,克隆了萜类代谢关键酶烟草5-磷酸脱氧木酮糖还原异构酶(dxr)的cDNA片段.该基因编码区长1422 bp,编码473个氨基酸残基.利用Clustal W(1.82)和Bioedit软件,对烟草与番茄(Lycopersicon esculentum)、长春花(Catharanthus roseus)、金鱼草(A ntirrhinum majus)、薄荷(Mentha piperita)、玉米(Zea mays)、拟南芥(A rabidopsis thaliana)、念珠藻(Nostoc sp.)等物种dar基因的同源性进行分析,其氨基酸同源性分别达到93.6%、87.9%、86.3%、84.6%、84.2%、82.9%和53.5%.原核表达结果证明,该基因编码蛋白的分子量约为50 kD,与氨基酸序列估算相符合.组织表达特异性分析表明,dxr基因在烟草组织中的表达强弱为花>叶>茎>腺毛>种子>根,在花和叶片中的表达量占优势.该结果对烟草萜类代谢的分子调控和品质改良具有重要的参考价值.     

鲈鱼6-磷酸葡萄糖酶催化亚基(G6PC)cDNA和5’侧翼序列的克隆及分析

6-磷酸葡萄糖酶(glucose-6-phosphatase,G6Pase,EC 3.1.3.9)催化6-磷酸葡萄糖水解产生磷酸和葡萄糖,即糖异生途径和糖原分解途径的最后一个限速反应.我们用SMART RACE技术从鲈鱼(Lateolabraxjaponicus)肝脏中克隆了6-磷酸葡萄糖酶催化亚基(glucose-6-phosphatase catalytic subunit,G6PG)基因cDNA序列.该序列全长1651 bp,5’端非翻译区75 bp,3’端非翻译区496 bp,开放阅读框1080bp,可编码一个由359个氨基酸组成的蛋白,该蛋白理论分子量40.45kD、等电点9.30(GenBank登录号:HQ317736.1).氨基酸序列分析表明,鲈鱼G6PC与胡瓜鱼(Osmerus mordax)、翘嘴红鲌(Erythroculter ilishaeformis)、慈鲷(Haplochromis nub ilus)、斑马鱼(Danio rerio)、黑青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)、金头鲷(Sparus aurata)、非洲爪蟾(Xenopus laevis、牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)及大鼠(Rattus norvegicus)11个物种的同源性达58％以上,其中与胡瓜鱼同源性最高,为85％.RT-PCR分析G6PC基因在鲈鱼肌、心、眼、脑、鳃、肝、肠、肾、脂和脾10个组织中的表达,在肝、肠和肾中有较高的表达,在脑和鳃只有微弱的表达.用基因组步移技术克隆了G6PC基因的5’侧翼区的序列1 243bp,表明该序列含有2个TATA box位点,2个胰岛素作用序列(insulin response sequence,IRS)及C/EBPb、CRE-BP、HNF-3b等潜在的转录因子结合位点.本研究结果表明,鲈鱼G6PC基因在肝、肠和肾中有高表达,其5’侧翼区存在多个转录因子结合位点,该结果为研究G6PC基因的表达调控机制提供了基础资料.     

杜梨精氨酸脱羧酶基因PbADC的克隆与表达分析

精氨酸脱羧酶(ADC)是植物多胺生物合成途径中的关键酶。为探索ADC基因在杜梨中的序列特征及其对非生物胁迫的应答特性,采用反转录PCR(RT-PCR)技术从杜梨中克隆PbADC基因,利用生物信息学软件进行序列分析,并通过荧光定量PCR技术检测其在不同组织中的表达水平和对多种非生物胁迫的响应。结果表明,PbADC基因的开放阅读框全长2 190 bp,编码730个氨基酸,预测PbADC蛋白含有66个磷酸化位点。结构域分析显示,PbADC含有保守的2-磷酸吡哆醛结合位点、磷酸吡哆醛(PLP)磷酸基结合位点和底物识别信号序列,是Ⅲ型磷酸吡哆醛依赖性精氨酸脱羧酶家族成员。在亲缘关系上与苹果MdADC、甜樱桃PaADC和桃PpADC较为接近。荧光定量PCR检测结果表明,PbADC在叶片中的表达量高于根和茎部组织,且该基因的转录水平受低温、脱水、盐和过氧化氢等非生物胁迫调控。本研究结果为进一步探讨PbADC基因的抗逆功能提供了理论依据。     

不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因cDNA全长的克隆与表达分析

以不结球白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)抗病自交系雪克青为实验材料,通过RACE技术,获得了不结球白菜β-1,3-葡聚糖酶基因的cDNA全长序列。序列分析发现,该基因全长1275bp,编码363个氨基酸,分子量40.66kD,等电点(pI)9.27。推导的氨基酸序列与芜菁bg1基因具有96%的同源性,与拟南芥bg2基因具有61%的同源性,与其它植物β-1,3-葡聚糖酶基因的同源性为49%￣57%。将该序列提交GenBank,登录号为AY836001。Southern杂交显示该基因在不结球白菜基因组中的拷贝数多于1个。半定量RT-PCR分析表明,该基因有低水平的组成型表达,在霜霉病菌(Peronosporaparasitica)诱导后24h其表达量达到高峰。     

西农萨能羊骨桥蛋白基因OPN的筛选、克隆和生物信息学分析

摘　要: 采用抑制性削减杂交技术构建西农萨能羊乳腺组织在泌乳初期和泌乳高峰期的差异表达基因文库, 筛选泌乳初期和高峰期乳腺组织差异表达基因,通过RT-PCR方法克隆西农萨能羊乳腺组织OPN的CDs区序列,用实时定量PCR分析OPN基因的表达水平变化,并进行序列比对和功能预测。结果成功构建了西农萨能羊不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因文库,克隆了乳腺组织OPN基因, GenBank登录号为: EU295699, 开放读码框由834个碱基组成,编码277个氨基酸,前16个氨基酸为推定的信号肽区域。西农萨能羊OPN与绵羊(AF_152416)、牛(NM_174187)、人(DQ_846871)、小鼠(NM_009263) 相应基因核苷酸同源性分别为98%、95%、71%和70%,氨基酸同源性分别为：98%、91%、55%和54%,泌乳初期乳腺组织中mRNA表达水平是泌乳高峰期的5.03倍;预测西农萨能羊OPN较人和小鼠OPN多2个潜在功能基序。     

石生植物有柄石韦生境的水分来源及其耐旱性分析

为了探究有柄石韦生境的水分来源及其耐旱性,在实地调查的基础上,梳理了有柄石韦生境的水分来源,从生理结构组织分析了有柄石韦的耐旱性。研究表明:(1)有柄石韦生境的水分来源有穗枝赤齿藓结皮截留的大气降水、有柄石韦叶片和穗枝赤齿藓结皮凝结水、雾水3个途径;(2)有柄石韦叶片结构组织具有发达的栅栏组织、厚角质层等特征,表现为极强的生理耐旱性。可以尝试将穗枝赤齿藓结皮和有柄石韦组合用于喀斯特裸岩植被修复。