杨树葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PDH）基因启动子的克隆与分析

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶是磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶,其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH,也为核酸合成提供戊糖;此外,还参加非生物逆境胁迫应答反应。因此,G6PDH对植物的生长发育起着非常重要的作用。本文利用甜杨G6PDH基因和毛果杨基因组序列,通过PCR获得了甜杨G6PDH基因上游1400bp的序列。序列分析结果表明,该序列具有启动子的基本元件TATA-box、CAAT-box。此外,还包含多个胁迫诱导元件,如低温诱导元件LTR,盐诱导元件GT-1,抗冻、缺水、脱落酸、抗寒元件MYB和MYC,以及光响应元件L-box、G-box、3AF-1、TC丰富区等。     

鲈鱼CD63基因克隆及表达分析

抗原分化簇63(cluster of differentiation 63,CD63)属于四次跨膜蛋白超家族成员,在细胞粘附、信号转导和免疫细胞激活中扮演重要角色。近年来鲈鱼(Lateolabrax japonicus)养殖病害严重,为加强鲈鱼疾病、免疫相关基础的研究,本实验通过cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆鲈鱼CD63 cDNA全长序列,共1 219 bp,包括114 bp的5'-UTR,723 bp的ORF和382 bp的3'-UTR,ORF编码240个氨基酸,蛋白质理论相对分子量为26.26 kD,等电点为8.43。该蛋白是四次跨膜蛋白,包括3个胞内区,4个跨膜区和2个胞外区,第2个胞外大环有保守的Cys-Cys-Gly结构和3个潜在的N-糖基化位点(Asn~(128),Asn~(150)和Asn~(172))。该蛋白羧基端有1个酪氨酸溶酶体靶基序(GYEVM,Gly-Tyr-GluVal-Met)。序列分析显示,鲈鱼CD63与其他鱼类有较高的相似性。qRT-PCR结果显示,CD63在鲈鱼肝、脾、头肾、肠、鳃、脂肪、肌肉、脑和血液中都有表达,其中肝脏、肌肉和头肾中表达量较高。腹腔注射哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)后6 h,鲈鱼头肾中CD63表达显著上调(P0.05)。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激巨噬细胞,24 h后CD63表达显著上调(P0.05)。聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C刺激12及24 h后,CD63表达量显著增加(P0.05)。结果表明,CD63在病原菌侵袭和免疫应答中发挥重要作用,这为进一步研究鱼类免疫应答分子调控网络提供了一定的理论基础。     

奶山羊ELOVL6基因启动子的克隆及活性区域分析

超长链脂肪酸延伸酶6(elongase of very long chain fatty acids 6,ELOVL6)主要催化C12～C16饱和或单不饱和脂肪酸的延伸,是长链脂肪酸延长反应的限速酶.本研究根据云南黑山羊(Capra hircus)的基因组序列(Gene ID:NW_005100691.1)设计引物,以血液DNA为模板,利用PCR技术扩增得到西农萨能奶山羊(C.hircus)ELOVL6基因启动子的全长序列,通过缺失分析,构建了10个包含ELOVL6启动子不同缺失片段的荧光素酶报告基因载体,与海肾荧光素酶对照报告基因载体(pRL-TK)共同转染西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性.结果表明,克隆得到ELOVL6基因启动子全长序列2 370 bp(包含转录起始位点上游2 168 bp),其与牛(Bos taurus)、人(Homo sapiens)和鼠(Mus musculus)的基因组序列同源性分别为94％、81％和80％,LO VL6启动子上无典型的真核生物启动转录元件TATA框.缺失突变研究发现,ELOVL6基因启动子前端存在负调控元件,启动子核心区域位于转录起始位点上游109～40 bp,该序列包含过氧化酶体增殖物激活受体(peroxisom prolifeator-activated receptor,PPAR)、肝X受体(liver X receptor,LXR)、胆固醇调节元件结合蛋白-1 (sterol-regulatory element binding protein-1,SREBP-1)、特异性蛋白1(specificity protein 1,Sp1)及核因子Y(nuclear factor Y, NF-Y)等转录因子的结合位点,本研究为ELOVL6基因启动子的功能研究提供理论依据.     

苹果α-法尼烯合酶基因的启动子序列及同源基因

本文通过设计引物进行PCR扩增α-法尼烯合酶(AFS)基因的5'端区段并测序,获得510bp的‘国光’苹果AFS基因启动子和5'端非翻译区(5'UTR)序列,已在GenBank注册(登录号FJ263961)。序列分析结果表明,该序列具有典型的启动子特征,在转录起始点上游-46bp处有一个TATA盒,-93bp处有一个CAAT盒,-84bp处有一个W盒和-436bp处有一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT。与‘皇家嘎拉’苹果的AFS基因启动子序列(GenBank登录号AY786553.1)比对,本研究发现‘国光’苹果AFS基因启动子序列中有6个碱基(-186T,-207T,-283C,-301A,-413A和-433A)发生变异,‘皇家嘎拉’苹果AFS基因启动子序列相应位置的碱基分别为碱基缺失、-206C、-282G、-300G、-412G和-432G。重要的是,其中‘国光’苹果-413A碱基变异为G发生在一个热胁迫反应顺式作用元件GAAATTTTTT中,苹果虎皮病发生和AFS基因的转录表达是否受到这一碱基变异的影响值得进一步探讨。本研究结果还表明,在苹果AFS基因启动子和5'UTR序列中存在一个正向...     

京海黄鸡IL-6基因启动子区多态性的生物信息学分析

前炎性细胞因子白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)在许多慢性炎症和自身免疫性疾病的发病机制中起着至关重要的作用,尤其是炎症性肠病。为了从分子水平上探讨IL-6基因的表达调控,本研究以京海黄鸡(Gallus gallus)为素材,通过基因组DNA测序技术,检测IL-6基因上游-2 200 bp至下游500 bp区域中的单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP),同时运用生物信息学软件预测IL-6基因核心启动子区转录因子以及CpG岛(CpG islands),分析所测SNPs以及该基因启动子区SNP突变前后转录因子和CpG岛的变化。测序结果表明,京海黄鸡中共检测到28个SNPs位点,其中位于5'调控区有19个,外显子区2个(均为同义突变),内含子区2个,3'区5个;在28个突变位点中,发现有4个为Gen Bank中未标注的SNPs,其中3个(G-357 A、C-447 G和A-663 G)位于5'调控区,1个位于3'区(C3177T)。生物信息学分析表明,有11个SNPs位于IL-6基因核心启动子区,并导致转录因子发生了改变;同时由于启动子区C-939G的突变,导致CpG岛区域由原来的3个变为2个,由此推测上述SNPs可能通过影响IL-6基因的启动子区转录因子以及甲基化区域的改变影响IL-6基因的表达调控。研究结果对进一步探讨IL-6基因的功能和作用,以及这些SNPs与鸡肠道炎症的抗性及生产性能的关系具有十分重要的意义。     

甘蔗蔗糖磷酸合成酶基因(SofSPSA)的克隆及正反义植物表达载体的构建

蔗糖磷酸合成酶(sPs)是植物体内控制蔗糖合成的关键酶.本研究通过搜索NCBI数据库获得迄今植物中所有的蔗糖磷酸合成酶基因序列共77条,其中全长序列43条;对全长序列进行进化分析表明,植物SPS基因分为A、B、C和D四个家族,同一植物体内有多个分别属于不同家族的SPS基因;比对A家族中进化关系很近的甘蔗(Saccharum officinarum )SofS PSl、水稻(Oryza sativa)OsSPS4、黑麦草(Lolium perenne )LpSPS和竹子(Bambusa oldhamii)BoSPS基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗A家族SPS基因(SofSPSA)2 553 bp序列,结合5’-RACE和3’-RACE技术获得甘蔗SofSPSA基因全长cDNA序列3 906 bp;该序列包含一个3 183bp的开放阅读框(ORE),编码1 060个氨基酸残基的蛋白,其理论分子量和等电点分别为l18.4kD和6.09.该序列的起始密码子(ATG)位于转录起始位点后359bp处,终止密码子(TAA)后还有一段365bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴(GenBank登录号:HM854011); SofSPSA与SofSPSⅡ、OsSPS4、LpSPS、BoSPS的氨基酸相似性分别为99.3％、91.8％、91.6％和91.9％,一致性分别为99.2％、87.9％、87.5％和87.8％;设计引物分别扩增正、反向SofSPSA基因ORF并分别连到pBI121上获得由组成型表达启动子35S驱动的正、反义植物表达载体pBI-SofSPSA和pBI-anti- SofSPSA,为进一步研究甘蔗SPS基因的生物学功能及利用甘蔗SPS基因改良作物品种提供科学依据.     

茶树海藻糖-6-磷酸合成酶基因(CsTPS)的克隆及表达分析

海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate synthase,TPS)是海藻糖合成途径中的一个关键酶.目前,TPS基因的研究多数集中于细菌和真菌等,而对植物的研究较少.本实验通过对茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)全器官转录组文库序列比对,获得一条与其他物种同源性较高的编码TPS基因的EST序列,通过RACE扩增后获得茶树TPS基因cDNA全长序列,命名为Cs TPS(GenBank登录号JQ742017).该基因cDNA全长3 125 bp,包含一个2799 bp的开放阅读框,编码932个氨基酸.多序列比对分析结果表明,Cs TPS基因编码的蛋白具有明显的TPS和TPP两个结构域.系统进化分析表明,其编码的氨基酸序列与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、烟草(Nicotiana tabacum)和番茄(Solanum lycopersicum)等植物的TPS同源性较高,且CsTPS与拟南芥TPS1(AtTPS1)的同源性高于TPS2(AtTPS2)和TPS3(AtTPS3).qPCR分析显示,CsTPS基因在茶树不同组织器官中呈现差异性表达.低温诱导促使老叶和嫩叶中的CsTPS基因上调程度明显大于根系,表明CsTPS基因可能参与了茶树抗寒机制.     

鲈鱼CD3基因cDNA克隆及诱导表达

T淋巴细胞分化抗原3(cluster of differentiation 3,CD3)分子表达于T细胞表面,并通过非共价键与T细胞受体(T cell receptor,TCR)连接,参与T细胞活化.本研究采用反转录PCR(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术从鲈鱼(Lateolabrax japonicus)肝脏中克隆了CD3γ/δ、CD3ε和CD3ζ基因全长.结果表明,CD3γ/δ全长cDNA为1 231 bp,包括99 bp的5'非翻译区(untranslated regions,UTR),583 bp的3'-UTR和549 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),共编码182个氨基酸;CD3ε全长cDNA为2 145 bp,包括186 bp的5'-UTR,1 434 bp的3'-UTR和525 bp的ORF,共编码174个氨基酸;CD3ζ全长1 281 bp,包括56 bp的5'-UTR,772 bp的3'-UTR和453 bp的ORF,共编码150个氨基酸.氨基酸序列分析发现,CD3γ/δ和CD3ε分子结构相似,均含有1个免疫球蛋白样结构的胞外区、1个跨膜区和含1个免疫受体酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)的胞浆区,而CD3ζ含有1个仅由5个氨基酸组成的胞外区、1个跨膜区和含3个ITAM序列的胞浆区.分析DNA和cDNA序列发现,CD3γ/δ的ORF区由6个外显子和5个内含子组成,CD3ε的ORF区由5个外显子和4个内含子组成.qRT-PCR结果表明,CD3γ/δ、CD3ε和CD3ζ在鳃、脾、头肾、肠中表达较高,在脂肪、肝、眼、脑等组织中表达较少.当腹腔注射哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)3 h后,脾组织的3种CD3分子均显著上调(P＜0.05),在肠和头肾也有显著上调(P＜0.05),表明细菌感染会增加CD3的表达.研究结果为进一步研究鱼类CD3在病原菌感染免疫中的分子机制提供基础资料.     

刺参核糖体蛋白L17基因(RPL17)全长cDNA克隆及组织表达

核糖体蛋白除组成核糖体、参与蛋白质合成之外,还作用于细胞的分裂、增殖、分化、凋亡、发育调控等过程.为了研究核糖体蛋白基因在刺参中的生理功能,本研究采用全长cDNA克隆技术首次从刺参(Apostichopus japonicus)体壁中克隆出核糖体蛋白L17基因(ribosomal protein L 17,RPL17)的全长cDNA序列(GenBank登录号:JQ922561).该基因cDNA全长643 bp,包括33 bp的5’-UTR,58 bp的3’-UTR,开放阅读框552 bp,编码183个氨基酸,编码的蛋白质相对分子量为21.5010kD,理论等电点(pI)为10.29,总平均亲水性(GRAVY)为-0.964,为不稳定的亲水蛋白.在NCBI网站上经Blastn和Blastx比对分析,发现该序列的核苷酸序列以及推导的氨基酸序列与其他物种的同源性均在70％以上,其中与紫海胆(Stron-gylocentrotus purpuratus)的同源性分别为75％和81％.二级结构预测结果:α螺旋占36.61％;β折叠占7.65％;无规卷曲占42.08％;其余13.66％为延伸链.蛋白功能位点分析显示其含有1个核糖体蛋白L22信号位点和9个磷酸化位点,其中cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点3个,蛋白激酶C磷酸化位点4个,酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位点2个.构建的系统进化树显示,刺参与同为棘皮动物的紫海胆聚为一支,分子进化地位上关系最近,其次聚类顺序较近的为玻璃海鞘、非洲爪蟾,脊椎动物聚为一支,该结果与这些物种在生物学上的分类是较一致的.利用荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测RPL17基因在刺参各组织中的表达,结果表明,RPL17基因在体腔细胞中表达量最高,肠中次之,呼吸树中最低.体腔细胞中的表达量分别为肠、体壁、纵肌、呼吸树的5.67、21.63、43.25和346倍,与4种组织的差异均极显著(P＜0.01).另外,肠与呼吸树中的表达量差异显著(P＜0.05),其余组织差异不显著(P＞0.05).本研究结果将为进一步研究刺参蛋白质合成、再生及多种生理活动的调控机制提供基础数据.     

甜高粱蔗糖合成酶基因（Susy2）的克隆及结构和功能分析

本研究以甘蔗蔗糖合成酶基因(susy2)cDNA序列为探针,对高粱EST数据库进行同源检索,将获得的4条与甘蔗相似性很高的EST序列进行拼接,后经基因组PCR、分子克隆和序列分析验证获得了甜高粱(sorghum bicofor)蔗糖合成酶基因DNA序列(Susy2,GenBank登录号为FJ513325).该序列全长4587 bp,起始密码子至终止密码子序列长4350 bp,包含一个2409 bp的开放读码框.该序列包含15个外显子和14个内含子,剪接方式都为GU/AG模式.Susy2编码的蛋白由802个氨基酸组成,分子量大小为91.7 kD,等电点pI为6.15.保守结构域分析表明,此蛋白含有一个475个氨基酸的GTI糖基化酶保守结构域(275～759),有4个ADP结合位点,能催化6-磷酸果糖和UDPG形成6-磷酸蔗糖.     

Editorial board page for “Archives of Agronomy and Soil Science”, Volume 6, Number 6

Abstract

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Einflußgrößen der Schwermetallöslichkeit und -bindung in Böden

Solubility and retention of heavy metals in soils Model experiments were carried out under oxidizing conditions with soil samples from surface and subsurface horizons of different composition in order to investigate the solubility and retention of Cu, Zn, Cd, and Pb in soils. The solubility of heavy metals is mainly determined by ad- and desorption processes and complexation reactions of organic and inorganic ligands. Precipitation and dissolution of definite heavy metal compounds do not seem to govern the solution concentration in soils. An exception may probably be the formation of lead phosphate and zinc silicate under specific reaction conditions. The main factors which determine solubility and retention of heavy metals are total amount (except the proportion incorporated in the silicate structure) of the different metals, soil reaction, content of mobilizing and immobilizing organic substances, content of pedogenic oxides and clay minerals, and kind and concentration of salts and inorganic ligands. The results of the model experiments are used together with the results of other authors and general physico-chemical data to give an interpretation of the solubility behaviour of heavy metals in soils. The relations between heavy metal solubility, availability and mobility and possible procedures for melioration of soils contaminated with heavy metals are discussed.     

Dietary intake of vitamin B6 and concentration of vitamin B6 in blood samples of German vegans

OBJECTIVE: The study aimed to evaluate the dietary vitamin B6 intake and determine the vitamin B6 concentration in blood samples of German vegans. DESIGN AND SETTING: Cross-sectional study with 33 examination sites all over Germany.Subjects Ninety-three vegans (50 females) with a mean (+/- standard deviation (SD)) age of 43.7 +/- 15.7 years who took no vitamin supplements. METHODS: Dietary intake was assed using a semi-quantitative food-frequency questionnaire. Erythrocyte aspartate aminotransferase activity coefficient (EAST-AC) was calculated as the ratio of stimulated (pyridoxal 5'-phosphate added) to unstimulated activity in blood samples that were provided after an overnight fast. RESULTS: Mean +/- SD vitamin B6 intake was 2.83 +/- 0.98 mg day(-1) and mean +/- SD protein intake was 56.6 +/- 21.7 g day(-1). Of the participants 4% showed vitamin B6 intakes lower than daily recommended intakes for Germany, 16% showed EAST-AC > 1.85, and a further 58% showed EAST-AC of 1.5-1-85. Moderate vegans were affected to a lesser extent than strict vegans. None of the established confounders was a significant predictor of EAST-AC. In logistic regression analyses the contribution of nutriments and cereals to pyridoxine intake was the only predictor of EAST-AC classified as < or = 1.85 and > 1.85, respectively. CONCLUSIONS: In spite of the high total intake of vitamin B6, an adequate concentration in blood samples could not be realised for a majority of the participants. Due to the health implications of a marginal pyridoxine status, vegans should be encouraged to include foods with a high bioavailability of pyridoxine, such as beans, lentils and bananas, in the daily diet.     

聚乙二醇化重组新型人白细胞介素-6的药代动力学研究

以双相氯胺-T法标记,应用^125I示踪技术对新研制的聚乙二醇化重组人白细胞介素-6（PEG-rhIL-6）的药代动力学进行研究,试验选取不分雌雄30只SD大鼠,随机分成6个组,1～3组皮下注射给药,剂量分别为40μg/kg（高剂量组）,20μg/kg（中剂量组）和3μg/kg（低剂量组）,4～6组静脉注射给药（剂量同...     

Zur Entstehung tiefhumoser Böden in der Calenberger Lößbörde bei Hannover

Development of Thick Humic Soils in the Calenberg Fertile Loess Plain near Hannover Different thick humic soils (Gray-brown podzolic soil [Parabraunerde], Chernozem, Colluvium) in the Calenberg Fertile Loess Plain (to the north of the Deister hills) are compared with each other in terms of history, distribution of soil types, morphology and chemical composition. The distribution of Chernozem and Colluvium is determined by the morphology of the area. The thick humic Gray-brown podzolic soils seem to be the result of agricultural land use over a long period of time. The soils can be clearly distinguished by different iron and phosphorus contents and their distribution in the soil profile. The increased phosphorus content of the Gray-brown podzolic soils is probably a result of the addition of plaggen and manure. Further investigations are in progress.     

苹果6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)基因cDNA克隆及其植物表达载体构建

山梨醇是一种糖醇,是蔷薇科木本植物主要的光合产物及贮运物质,6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)是其合成的关键酶(马锋旺和李嘉瑞,1993)。近年来,人们利用基因工程手段将S6PDH cDNA导入烟草(Tao et al.,1995)、柿(Gao et al.,2001)中,发现转基因植物可合成山梨醇,且使转基因植物抗性