影响兔胚胎细胞核移植效率的因素

 对兔胚胎细胞核移植（NT）的有关影响因素进行了系统研究。结果发现电场强度100 V·mm-1，脉冲时间15μs，电脉冲3～4次的融合率显著高于其它组（P<0.05）；融合前激活卵母细胞，分裂率和囊胚率显著高于融合后激活（P <0.05）；当用8～16-细胞胚胎的卵裂球作供核时，卵裂率和囊胚率显著高于致密桑椹胚卵裂球为供核组；当重组胚在含3%发情牛血清（OCS）的TCM199中培养48 h后，转入含10% FCS的TCM199中继续培养，卵裂率和囊胚率显著高于一直在3% OCS或10% 胎犊血清（FCS）中培养的重组胚（P < 0.05）。将22枚2～4-细胞期重组胚移入同期发情的受体母兔输卵管内，34 d后产下NT仔兔1只。结果表明，电融合参数和供体胚胎的发育阶段以及受体卵母细胞的状态对NT效果有显著影响，在NT胚胎的不同发育阶段采用不同的血清种类和浓度可提高其胚胎发育能力。     

EGF对牛卵母细胞体外成熟及胚胎发育的影响

在卵母细胞体外成熟液(含FSH)中分别添加10,30,50ng/ml表皮生长因子(EGF),24h后检查成熟率,并进行孤雌激活。结果表明:添加10ng/ml、30ng/mlEGF组牛卵母细胞成熟率较对照组(未添加EGF)无显著差异(79.8%vs71.5%vs70.4%,p>0.05),但EGF添加至50ng/ml时牛卵母细胞第一极体排出率显著提高,达85.4%(P<0.01);在实验1的基础上,比较培养液中添加10ng/ml、30ng/ml、50ng/mlEGF对牛孤雌激活胚胎体外发育的影响,结果发现在培养液中添加EGF并不能显著提高牛卵母细胞体外孤雌发育囊胚率(P>0.05),但可显著提高其囊胚孵化率(P<0.01)。     

不同融合条件对水牛体细胞核移植效果的影响

本研究主要探讨水牛体细胞核移植电融合的影响因素,以摸索出适合水牛体细胞核移植的电融合条件。结果显示:直流脉冲前施加2 .0 V交流电波能显著提高Φ<1 5 μm供体细胞的融合率及胚胎的卵裂率( P<0 .0 5 ) ,但对其存活率和囊胚率以及2 0 μm<Φ<3 0 μm供体细胞的融合率、胚胎的存活率、卵裂率及随后的囊胚发育率无显著影响( P>0 .0 5 ) ;然而无论施加交流电与否,直径2 0～3 0 μm供体细胞的囊胚率均显著高于直径小于1 5 μm供体细胞的囊胚率( P<0 .0 5 )。注核操作液中添加聚乙烯醇( PVA)对重组胚的融合率和卵裂率没有显著影响( P>0 .0 5 ) ,但激活后重组胚的存活率( 95 .83 %)及囊胚发育率( 1 1 .3 2 %)显著高于对照组的重组胚存活率( 74.77%)和囊胚率( 3 .75 %,P<0 .0 5 )。结果表明:( 1 )直流脉冲前施加2 .0 V交流电波能提高直径较小供体细胞的融合效果;( 2 )注核操作液中添加0 .1 %聚乙烯醇有利于提高水牛体细胞核移植的效果     

荧光染色及紫外照射(UV)对黄牛孤雌和克隆胚胎早期发育的影响

探讨荧光染色及紫外照射对牛孤雌和克隆胚胎体外发育的影响。结果发现，1／4倍UV照射20、30、40S的卵母细胞孤雌激活后囊胚发育率都极显著低于UV照射0S和10s组；以1、1／4、1／8、1／32倍的UV强度照射黄牛卵母细胞20S，其中1／4倍UV照射组的分裂率与1／8、1／32倍UV照射组无显著差异，但囊胚率间差异显著。以1倍UV强度照射组的分裂率与囊胚率均显著低于1／8、1／32倍UV强度照射组；观察培养24h后原核形成情况，发现1倍UV强度照射组原核形成也显著滞后于其它处理组；比较1、1／8倍UV强度照射引导去核胞质构建的重组胚体外早期发育情况，发现1倍UV强度照射引导去核胞质重组胚的卵裂率及囊胚率极显著低于1／8倍UV照射强度引导去核胞质组。以上结果表明：1／4倍UV强度照射黄牛卵母细胞时间大于20s，显著降低其孤雌激活后的卵裂和体外发育潜力；1、1／4倍UV照射强度可阻滞原核形成，降低UV照射强度可提高胚胎孤雌发育率；1／8倍UV照射强度可用于引导去核操作。     

不同来源的供体细胞对水牛体细胞核移植效果的影响

采用电融合方法,探讨不同来源的供体细胞对水牛核移植效果的影响。体外成熟培养22～24h的水牛卵母细胞,在含有5μg/mL细胞松弛素B的操作液中进行去核,然后将经0.1μg/mLAphidicolin(APD)+0.5%FBS培养2～9d的水牛不同来源的供体细胞,注射到去核的卵母细胞卵周隙中,电融合形成重构胚。重构胚经5μmol/L离子霉素激活处理5min,并在2mmol/L的6-DMAP中培养3h后,在含有颗粒细胞单层细胞的微滴中培养7～9d,观察其卵裂和胚胎发育情况。结果发现,来自水牛胎儿耳部或腹部组织块的成纤维细胞用作供体细胞,其重组胚的融合率及体外发育能力差异不显著(P>0.05),且细胞培养方法(组织块法或酶消化法)对其核移植效果没有影响;来自编号011010的胎儿耳皮成纤维细胞重组胚的囊胚发育率显著高于来自编号030323和030410细胞(31.45%vs10.96%和14.49%,P<0.05),但它们的融合率、卵裂率无显著差异(P>0.05)。以上结果表明:经不同培养方法培养的细胞或来自身体不同部位的组织的成纤维细胞均可作为核移植研究的供体细胞,但是水牛体细胞核移植效果受供体的个体差异的影响。     

高产荷斯坦奶牛体内胚胎生产技术的初步研究

对荷斯坦奶牛超排技术环节中的影响因素进行初步探讨,结果发现,青年荷斯坦奶牛进行超排处理也可获得较好的结果;在广西炎热的7~9月份也可进行超排处理,可回收胚胎(8.4±3.8)枚/头,超排结果与其他季节差异不显著;进行荷斯坦奶牛重复超排的时间间隔可缩短到25~30 d。     

小鼠ES细胞神经分化的方法比较研究

采用类胚体法(EB)的EB分化4-／4 程序和单层分化法研究不同的实验方法对胚胎干细胞神经分化的影响。用4-／4 分化程序进行胚胎干细胞的神经分化时，饲养层细胞的存在对类胚体的形成无影响，在神经分化的13d，仍可观察到46C细胞的Sox1-GFP绿色荧光，此时的免疫染色结果显示，分化细胞中除了有Nestin阳性的神经干细胞及胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性的神经胶质细胞外，以β-tubulin Ⅱ阳性神经元细胞最为多见，这些神经元呈现出多种形态；用单层分化法进行胚胎干细胞(ES)细胞的神经分化至13d时，分化形成的神经细胞种类与类胚体法相同，但神经元的细长纤维形成了复杂的网状结构，提示两种分化方法获得的神经元处于不同发育阶段。研究结果表明，两种分化方法均能为ES细胞提供从神经分化的起始到继续分化所需的环境，EB分化法适合于大量地获取分化的细胞，而单层分化法可直观地研究分化过程的细胞变化。     

黄牛体细胞核移植初步研究

对牛体细胞核移植的有关影响因素进行了系统研究,结果表明,电场强度为100v／mm,电脉冲2次,脉冲时间为10μs的融合率显著高于30μs的融合率,囊胚发育率差异不显著;在耳部成纤维细胞的注核微滴中添加7％乙醇可提高重组胚的卵裂率,供体细胞的预激活可提高核移植效果;TⅠ期(第二次减数分裂末期)去核卵母细胞核移植总囊胚率低于MⅠ期(第二次减数分裂中期)去核卵母细胞的,TⅠ期去核卵母细胞的核移植效果不如MⅠ期去核卵母细胞的;成纤维细胞直接注射后3h用离子霉素(5μmol／L,5min)和6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP,2mmol／L,3h)激活处理的重组胚发育率显著高于注核后0h和6h激活的重组胚,供体细胞核与受体卵母细胞激活前的胞质因子互作一段时间,有利于核移植胚胎的早期发育。     

供体细胞种类对牛核移植效果的影响

供体细胞种类对牛卵母细胞核移植效果影响的研究结果表明,颗粒细胞的核移植效果与成年牛成纤维细胞无显著差异(19.8%vs 17.3%,P>0.05);胎牛成纤维细胞核移植囊胚发育率高于成年牛成纤维细胞(24.2%vs 14.0%,P<0.05);血清饥饿处理的胎牛成纤维细胞(休眠细胞)与高血清培养(非休眠细胞)的胎牛成纤维细胞核移植效果差异不显著(18.8%vs 18.6%,P>0.05),表明胎牛成纤维细胞血清饥饿处理没有必要。     

不同石蜡油对水牛孤雌激活胚胎体外发育的影响

水牛孤雌激活胚胎体外培养时采用石蜡油覆盖微滴培养,本文就几种不同石蜡油(协和油、Ameresco油、Sigma胚胎培养油和Sigma过滤油)对水牛孤雌激活胚胎体外发育的影响进行了研究。结果显示:在分裂率、孵化率上,不同石蜡油之间无明显差异;在7d囊胚率和总囊胚率上,分别为协和油32.1%、39.4%,Sigma胚胎培养油39.9%、42.8%,Sigma过滤油34.4%、40.2%,几组之间差异不显著;而Ameresco油7d囊胚率和总囊胚率分别为22.9%、28.8%,与Sigma胚胎培养油、Sigma过滤油之间差异显著(P<0.05)。