pGH和IGF-Ⅰ双基因共表达载体的构建及转双基因猪的获得与检测

旨在构建可高效表达pGH基因和IGF-Ⅰ基因的双基因共表达载体,制备转双基因(pGH+IGF-Ⅰ)猪,以期探索pGH基因和IGF-Ⅰ基因对猪生长发育的影响,为节粮型高瘦肉率新品种猪的培育奠定理论基础。从长白猪耳样中提取总RNA,经反转录RT-PCR获得pGH基因不含终止密码子的编码序列和IGF-Ⅰ基因完整的编码序列,经酶切连接克隆至pc DNA3.1(+)真核表达载体上,构建pc DNA3.1(+)-pGH-IGF-Ⅰ双基因共表达载体。将其转染PK15细胞,Q-PCR检测2个目的基因在PK15细胞中的表达情况。将构建的双基因共表达载体用纳米材料包裹后转染长白猪精子,采用精子载体法制备转双基因猪。PCR及测序鉴定转双基因阳性个体,Q-PCR检测2个目的基因在转双基因猪体内的表达情况。PCR及测序鉴定追踪检测转双基因猪体内pGH基因和IGF-Ⅰ基因的稳定情况。RT-PCR及测序结果表明,成功克隆了长白猪的pGH基因和IGF-Ⅰ基因的编码序列。酶切和测序分析表明成功构建了双基因真核共表达载体,转染PK15细胞后,Q-PCR检测表明,pGH基因和IGF-Ⅰ基因均在mRNA水平成功表达。母猪妊娠获得13头仔猪,经PCR及测序检测,其中4头仔猪为转双基因阳性,转双基因阳性率为30.76%。Q-PCR检测外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因在转双基因猪体内成功表达。1~7月龄均可检测到外源pGH基因与IGF-Ⅰ基因,证明2个外源基因在转双基因猪体内稳定存在,并未随着生长而丢失。在转双基因公猪的精液中均能检测到2个外源基因,证明外源基因存在稳定传代的可能。     

基于脾脏转录组筛选北京油鸡和广明白鸡抗热应激相关功能基因

旨在通过对北京油鸡(BY)和“广明2号”白羽肉鸡B系(广明白鸡,GM)在热应激和正常饲养条件下的脾脏转录组进行分析,鉴定两鸡种在应对热应激时的差异表达基因和信号通路,解析不同鸡种耐热性能差异的分子调控机制。试验动物采用相同饲养条件下的25日龄北京油鸡和广明白鸡,测定异嗜性粒细胞与淋巴细胞的比值(H/L)、超氧化物歧化酶(SOD)和总抗氧化能力(T-AOC)等表型数据,采集脾脏组织进行转录组测序(RNA-Seq)。基于RNA-Seq数据,结合表型进行加权基因共表达网络分析(WGCNA),筛选出与性状相关性较高的模块与基因。脾脏转录组测序结果表明,热应激组相比于对照组,北京油鸡中共鉴定到313个差异表达基因,其中169个上调表达,144个下调表达;广明白鸡中鉴定到235个差异表达基因,其中152个上调表达,83个下调表达。利用WGCNA分析,在北京油鸡中筛选出2个与H/L相关性较高的模块,在广明白鸡中筛选出4个与H/L和T-AOC强相关的模块。通过筛选模块中的Hub基因,发现两品种中均存在TRIM29基因,说明该基因可能在抗热应激方面发挥重要作用。本研究通过转录组分析,揭示了不同鸡种在热应...     

猪传染性胃肠炎病毒S与M基因融合表达载体及IRES连接双基因共表达载体的构建

目的:研究如何提高猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)中主要抗原基因S与M基因对猪传染性胃肠炎的免疫调节作用,进一步探究基因疫苗的有效开发途径。方法:通过两种方法应用牛β酪蛋白启动子构建S和M融合基因表达载体以及构建IRES连接M和S双基因共表达核酸疫苗载体。结论:成功构建好M和S融合基因表达载体及IRES连接的M和S双基因真核共表达载体,并为利用乳腺生物反应器生产可食性疫苗提供有效措施。     

共表达内溶素和人溶菌酶基因的重组腺病毒构建

为研究内溶素SAL-2和人溶菌酶h LYZ的联合抑菌作用,本研究通过PCR方法分别从携带SAL-2和h LYZ基因的质粒中扩增目的片段,连接至腺病毒穿梭载体的多克隆位点上,构建重组穿梭载体p Shuttle-SAL和p Shuttle-LYZ。成功构建的重组穿梭质粒与Ad-easy骨架质粒在BJ5183中发生同源重组,重组得到的阳性重组腺病毒载体在脂质体介导下转染HEK293细胞,包装产生重组腺病毒Ad-SAL、Ad-LYZ、Ad-SALLYZ和对照重组腺病毒Ad-GFP,通过RT-PCR和Western blot方法检测mR NA和蛋白表达后,将构建的重组腺病毒进行扩增纯化并测定病毒滴度。结果表明,成功构建的重组腺病毒感染细胞后,SAL-2和h LYZ基因的mR NA均有表达,Western blot分别检测到28.6 ku和14.7 ku目的蛋白条带。扩增纯化后经TCID50方法检测病毒滴度分别为108.17TCID50/mL、108.50TCID50/mL、108.63TCID50/mL和107.60TCID50/mL。表明成功构建包装的重组腺病毒对HEK293细胞具有较强的感染能力,可稳定介导SAL-2基因和h LYZ基因在HEK293细胞中的表达。     

羊痘病毒P32基因与羊CD58基因共表达载体的构建

为了开发出一种可行的羊痘基因疫苗,尝试用羊P32基因与CD58基因建立共表达载体.试验根据GenBank中收录的羊痘病毒(GPV)P32和羊CD58基因组序列,设计了扩增GPV P32基因和CD58基因的特异性引物,运用PCR技术从GPV中扩增出P32基因,从羊的外周血中扩增出CD58基因,并将其分别克隆到pMD18-T载体,测序正确.将P32基因去掉后端疏水区一段与CD58基因先后克隆至载体pBudCE4.1,并转化大肠埃希菌JM109,提取质粒通过酶切鉴定和测序正确,且读码框正确.说明成功获得了真核共表达质粒pBudCE4.1/CD58/P32.     

玉米ZmNRT关键基因挖掘以及氮响应基因共表达网络构建

以玉米自交系B73（V4版本）作为参考基因组,利用生物信息学方法鉴定玉米ZmNRT基因家族成员,从系统发育关系、GO（Gene Ontology）富集、基因结构和玉米不同时期及组织下的表达谱等方面全面解析玉米ZmNRT基因家族。基于qPCR实验和共表达网络分析,对玉米ZmNRT家族基因在氮响应中的作用进行系统的研究。结果表明,在玉米全基因组水平上共鉴定到 162 个 ZmNRT 基因,主要分为 ZmNRT1（62 个）和 ZmNRT2（100 个） 两大类群。GO富集发现,仅46个基因参与硝态氮转运过程,这些基因被不均等分成7个亚家族,每个家族1～15个基因。基因表达模式分析结果显示,不同生育期和组织下ZmNRT基因表达是差异的。在氮诱导下,qPCR鉴定结果显示,12个ZmNRT基因是氮响应基因,9个基因表达上调,3个基因表达下调。共表达网络结果发现,其中10个ZmNRT基因与已知的氮代谢基因存在显著共表达关系（|r|>0.8 p-value<0.05）,推测这10个基因可能是调控玉米氮代谢的关键基因。     

乳酸菌融合表达传染性法氏囊病毒VP2蛋白与大肠杆菌LTB及其诱导免疫应答的研究

为研究传染性法氏囊病毒(IBDV)保护性抗原VP2与E.coli不耐热肠毒素B亚单位(LTB)在戊糖乳杆菌(L.pentosus)中的共表达及其免疫原性,本研究以乳酸杆菌表面表达型和分泌表达型质粒pPG-1和pPG-2为载体,以VP2为目的基因,构建VP2基因单独表达及与LTB基因融合表达的4种重组L.pentosus,分别命名为pPG-1-VP2/L.pentosus、pPG-1-VP2-LTB/L.pentosus、pPG-2-VP2/L.pentosus及pPG-2-VP2-LTB/L.pentosus。表达的重组蛋白分子量大小分别约为47 ku、55 ku、45 ku及53ku。将构建的重组L.pentosus分别口服免疫SPF雏鸡,以IDEXX试剂盒测定体液免疫应答水平,结果显示,不同表达方式的重组L.pentosus均可以刺激机体产生特异性循环抗体和分泌抗体(sIgA),其中pPG-2-VP2-LTB/L.pentosus诱导产生的抗体滴度高于其它组。MTT法检测不同表达方式的重组乳酸菌免疫雏鸡外周血淋巴细胞增殖反应,结果显示特异性抗原对免疫雏鸡淋巴细胞的增殖指数显著高于未免疫组,表明重组菌能够刺激机体产生特异性细胞免疫应答。这些结果表明4种重组菌均能够刺激机体产生局部黏膜免疫和全身系统免疫应答;并且带有黏膜免疫佐剂LTB融合表达试验组高于VP2蛋白单独表达组。     

两段牛乳铁蛋白肽基因在乳酸乳球菌中的共表达

根据乳酸乳球菌密码子的偏嗜性,优化设计并合成牛乳铁蛋白肽的两段基因序列LFcinB和LFampin,将其与乳酸乳球菌表达载体pAMJ399分别用SalⅠ和BglⅡ双酶切后进行连接,并电转化至乳酸乳球菌MG1363中,经酶切鉴定表明获得带有两段牛乳铁蛋白肽基因的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFcinBA/MG1363。结果表明,优化表达条件,在GM17培养基中添加3.8%的β-甘油磷酸二钠可以获得表达重组蛋白的适宜pH,West-ern-blot检测可见重组蛋白大小约13 ku,表明牛乳铁蛋白肽在重组乳酸乳球菌中获得了表达。     

基于共表达网络分析发掘调控玉米株高发育的关键ZmGRF基因

生长调控因子(growth-regulating factors,GRF)基因家族是一类植物特有的转录因子。在模式植物水稻、拟南芥中,部分GRF基因被证实是影响株高发育的核心调控因子。利用加权基因共表达网络分析方法(Weighted Gene Co-expression Network Analysis, WGCNA),初步构建以玉米ZmGRF基因与调控株高发育的功能基因为核心的共表达网络。结果表明,有9个ZmGRF基因与已报道的调控株高发育基因具有显著的共表达关系,并呈现出网络化的共表达模式,推测这9个ZmGRF基因是调控玉米株高发育的潜在候选基因。进一步通过微共线性分析发现,9个ZmGRF候选基因中有8个基因可以形成基因对,并且所有基因对的Ka/Ks值均显著小于1,暗示调控株高发育候选ZmGRF基因功能的保守性。