基因打靶备乳腺生物反应器研究进展

基因打靶技术是建立在胚胎干细胞和同源重组技术之上,可对基因组进行定点修饰的实验方法。用基因打靶技术制备乳腺生物反应器,克服了显微注射法的众多缺陷。本文简述了制备乳腺生物反应器过程中基因打靶的策略、靶细胞、打靶位点及国内外研究进展和展望等。     

家蚕条件基因打靶技术的建立及应用研究进展

条件基因打靶技术是通过借助位点特异性重组酶和预先引入宿主基因组的重组酶特异识别位点,在宿主特定发育阶段的组织或细胞中实现目标基因时空特异性定点插入、删除、替换和倒位等突变操作的技术。目前条件基因打靶技术已被广泛应用于拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)、小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)等高等真核模式生物的功能基因研究,并逐渐成为转基因动植物研究领域进行基因操作的强有力工具。近年来,国内外多个研究机构系统地开展了家蚕(Bombyx mori)条件基因打靶技术的开发研究,目前已经建立了较为完善的基于多种不同位点特异性重组系统的家蚕条件基因打靶技术平台。本文较为全面地介绍目前最为常用的位点特异性重组系统的组成和作用原理,系统概述基于位点特异性重组系统的家蚕条件基因打靶策略及其应用,并对家蚕条件基因打靶技术存在的主要问题和发展趋势进行讨论。     

TALEN介导猪瘟病毒结构蛋白基因E0敲入山羊乳腺上皮细胞β-乳球蛋白基因座

验证整合于山羊β-乳球蛋白基因座的猪瘟病毒E0(CSFV E0)基因是否能够利用内源性启动子调控该基因表达,为制备转CSFV E0基因山羊做好准备。利用脂质体转染的方法将实验室已构好的针对山羊β-乳球蛋白基因第一外显子的TALENs表达载体和包含CSFV E0基因的打靶载体共转染山羊乳腺上皮细胞,用药物(G418)进行筛选获得单克隆,并对获得的克隆进行5′端和3′端鉴定,鉴定都为阳性的克隆进行激素诱导24h后,收集培养液和细胞。通过RT-PCR和Western blot技术检测证明,转基因阳性细胞能够表达并分泌出CSFV E0蛋白。本试验为以转CSFV E0基因细胞为供核体进行核移植制作转基因动物奠定了基础。     

植物基因打靶的研究与应用

本文分析了影响基因打靶效率的因素,并指出提高同源重组利用率和在靶基因位点处引入DNA双键断裂可以提高基因打靶效率,总结了近年来这两方面尝试在植物中的研究进展,并与一些其他物种中的研究作出比较.     

基因打靶载体选择标记盒的构建及表达

为构建山羊乳腺基因打靶载体的选择标记盒,将loxP位点分别引入正、反向引物,以含新霉素磷酸转移酶(neo)基因的质粒pTarget为模板,用高保真聚合酶链反应(PCR)扩增得loxP neo loxP选择标记盒。将PCR产物克隆到pGEM T载体后进行的序列分析结果显示,引入的loxP位点及扩增后的neo基因序列均是正确的。将此选择标记盒克隆到不含neo基因的真核表达载体ΔpTarget后转染COS 1细胞,经过G418筛选获得药物抗性细胞克隆。再将此选择标记盒克隆到山羊β 乳球蛋白基因打靶载体并转染山羊成纤维细胞,经过G418选择后也获得抗性细胞克隆。结果表明:克隆的loxP neo loxP选择标记盒可用于基因打靶载体的构建。     

多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究

在转基因动物的研究中,一般采用随机插入的方法。基因在受体动物的基因组中随机整合,严重制约了转基因动物外源基因的稳定遗传,是转基因动物研究亟待解决的问题。转基因定点整合技术,即基因打靶技术是解决上述问题的重要途径,但是基因打靶存在打靶效率太低的问题。本研究小组已建立了体外动物细胞的多位点基因打靶技术,并构建了用于鳜鱼的体内多位点基因打靶的打靶载体,本文开展多位点基因打靶技术的鳜鱼体内实验研究。以鳜鱼rDNA基因(编码rRNA的基因)及其间隔序列作为同源重组引导序列,构建含干扰素基因的打靶载体,以其间隔序列为靶位点,针对鱼类胚胎发育特点,采用精子介导技术进行多位点基因打靶,最终获得定点整合干扰素基因的鳜鱼,并建立一套适用于动物的基因定点敲入的体内基因打靶技术。主要研究内容如下:(1)采用组织培养方法,获得鳜鱼头肾淋巴细胞和脾淋巴细胞,采用脂质体介导法使多位点基因打靶载体在鳜鱼的细胞上实行基因转移。采用正负筛选方法,利用筛选药物G418和GCV(更昔洛韦)筛选转染后的细胞两周后,对存活细胞进行DNA水平和RNA水平鉴定。结果证明了干扰素基因在鳜鱼细胞上实现了定点整合和稳定表达。(2)利用精子介导法将经线性化处理后的多位点基因打靶载体在鳜鱼的胚胎上实行基因转移。(3)根据靶位点定点整合的正负筛选原理,利用筛选药物G418和GCV筛选与富集定点整合后的阳性鱼胚或鱼苗,结果成功孵化出106尾转基因鳜鱼鱼苗。(4)培育6个月后,取20尾转基因鳜鱼进行鉴定。采用PCR、RT-PCR、测序等方法进行定点整合的鉴定。结果表明:6尾检测到已转入的基因——干扰素基因,其中有3尾实现了定点整合并表达。本研究率先将多位点基因打靶技术应用到转基因鱼的研究中,建立一套适用于鱼类的高效、安全的多位点基因打靶技术,并获得外源基因定点整合并表达的鳜鱼。     

鱼类基因组研究概述

本文概述了近些年鱼类基因组研究的进展状况,鱼类基因组研究起步比较晚,但目前在鱼类遗传连锁图谱的构建、功能基因的筛选与克隆,胚胎干细胞和基因打靶技术的研究上已经取得很好的进展.具体研究在淡、海水鱼类中都有所体现,并且对与鱼类密切相关的藻类的基因组也进行了研究.     

动物基因打靶技术的原理与应用

基因打靶是利用同源重组的原理 ,定点修饰目的基因组上特定位点的基因 ,定向地改变生物遗传特性的方法 ,作为新兴的遗传工具 ,它有着广泛的应用前景。     

山羊MSTN基因打靶载体的构建与鉴定

根据绵羊、猪、小鼠和牛的肌肉生长抑制素(MSTN)基因序列设计引物,通过PCR方法扩增了山羊MSTN基因的5'同源臂和3'同源臂,其长度分别为5.2 kb、1.1 kb。在ploxPneo载体的neo基因上游和下游分别插入上述2个同源臂,经PCR、限制性内切酶鉴定及DNA序列测定,证实该载体的2条同源臂包含山羊MSTN基因的相应外显子及其邻近的部分内含子,从而成功构建了山羊ploxP-MSTN打靶载体。     

人白介素-2基因打靶载体的构建、转染及鉴定

为研究人白介素2基因在奶山羊胎儿成纤维细胞中的表达,构建人白介素-2基因的山羊β-酪蛋白位点打靶载体。以质粒pBCI为模板扩增山羊β-酪蛋白上游2．5kb和下游3．5kb的序列作为5’和3’同源臂,将克隆得到的人白介素2基因和neo基因插入到2个同源臂之间,获得山羊β-酪蛋白基因打靶载体pBN153。利用脂质体将重组质粒转染奶山羊胎儿成纤维细胞进行G418筛选,并采用PCR和实时定量PCR方法对人白介紊-2基因在稳定株中的表达进行验证。检测结果表明,本试验构建的打靶裁体pBN153成功转染奶山羊胎儿成纤维细胞,将人白介素2基因成功整合至奶山羊胎儿成纤维细胞基因组中,为通过体细胞核移植法制备人白介素-2基因乳腺生物反应器的研究奠定了基础。