转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

大花君子兰叶绿体基因组及其特征

采用Illumina MiSeq测序平台对大花君子兰（Clivia miniata）叶片总DNA进行测序，通过组装获得了其叶绿体基因组（cpDNA）全长序列（158 114 bp）。对其cpDNA注释得到135个基因，包含87个蛋白编码基因、40个tRNA基因和8个rRNA基因。采用生物信息学方法对获得的cpDNA进行简单序列重复（SSR）分析和密码子偏好性分析。结果显示：①大花君子兰cpDNA中共有61个SSR位点，其中单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复数分别为38、9、2、8、3和1个，多数SSR分布在基因间隔区；②大花君子兰cpDNA密码子偏爱以A或U（T）结尾，亮氨酸使用频率最高，半胱氨酸使用频率最低。基于24种植物的cpDNA全长和23种植物的叶绿体ycf2基因序列进行系统发育分析，结果显示大花君子兰与石蒜科植物在同一分支，显示最近的亲缘关系，支持大花君子兰属于石蒜科。基于叶绿体ycf2的系统发育分析结果与基于cpDNA全长的系统发育分析研究结果大部分相同，支持ycf2基因可以代替cpDNA全长用于植物系统发育分析。     

马疱疹病毒1型主要毒力基因分析及TK基因缺失载体的构建

为了解新疆马疱疹病毒1型（EHV-1）主要毒力基因遗传进化情况并构建TK基因缺失株，本研究以EHV-1 XJ2015株DNA为模板，对其主要毒力基因TK、gI和gE全长进行克隆、测序及生物信息学分析，并扩增TK基因左右重组臂TKL和TKR，构建质粒pUC-TKLR，将扩增后的增强绿色荧光蛋白（EGFP，含有CMV+polyA）插入pUC-TKLR质粒，构建TK基因缺失打靶质粒。TK、gI和gE基因同源性分析结果显示，XJ2015株与国外EHV-1分离株TK、gI和gE基因同源性均较高，分别为99.8%~100.0%、99.6%~100.0%和99.9%~100.0%；与EHV-3分离株同源性均最低，分别为72.9%、59.4%和62.1%；遗传进化分析显示，3个基因均与国外EHV-1同属于一个遗传进化分支，与EHV-9和EHV-4进化关系较近，但与EHV-3进化关系较远，表明XJ2015毒株与国外EHV-1毒株TK、gI、gE基因核苷酸上差异不明显，没有明显的地域性特征，功能基因保守且进化缓慢，同源基因功能相同或相近；经PCR扩增、酶切、测序及转染鉴定，本试验成功构建了用于TK基因缺失的打靶质粒pUC-TKLR-EGFP。通过对EHV-1主要毒力基因的分析及TK基因缺失打靶载体的构建，为新疆地区马鼻肺炎流行病学调查分析、TK基因缺失株的构建提供理论依据。     

秀珍菇原基形成相关基因PpFBD1的克隆与表达研究

前期研究中通过对秀珍菇经低温诱导后不同发育阶段样本进行转录组测序及差异表达基因分析发现,ID为Cluster-6377.64510的基因(命名为PpFBD1)在原基形成前期的样本中高表达。为进一步了解分析其表达特性及功能,根据转录组测序结果设计特异性引物,利用RT-PCR技术从秀珍菇中克隆获得了该基因的cDNA全长。该基因由342个核苷酸组成,编码一个由113个氨基酸组成的蛋白,蛋白相对分子质量约11 ku。进化树分析显示,PpFBD1编码蛋白与糙皮侧耳hydrophobin1编码的疏水蛋白亲缘关系最近。Gene Ontology功能分析表明,PpFBD1主要参与真菌类细胞壁的合成。荧光定量RT-PCR检测显示,该基因在菌丝体经低温诱导后恢复至室温阶段(原基形成前期)表达量最高,这表明其可能参与调控秀珍菇原基形成过程。本研究结果为阐明秀珍菇原基形成机制提供参考。     

猎豹与虎猫杯状病毒的分离及其超变区基因比较研究

用F81细胞从上海某动物园患口腔溃疡的猎豹和虎的唾液病料中分离获得两株杯状病毒，经形态学、理化学、生物学鉴定和病毒核酸超变区基因RT-PCR扩增与序列测定证明两株病毒均为猫杯状病毒(FCV)，分别命名为FCV/cheetah/Shanghai/02/2002与FCV／tiger/Shanghai／03/2002。人工感染猫可引起体温升高，口腔溃疡，食欲下降等症状。两株病毒的超变区序列520bp长片段问的同源性为99.2％，与国内桂林虎分离株(TFCV9710)的同源性为74．0％，与国外分离株的总体同源性为58．1％，说明不同宿主或同种不同个体间杯状病毒分离株超变区核酸差异十分显著，符合猫杯状病毒的分子生物学特征。     

鸡的微卫星DNA标记与胴体性状的相关分析

测定了青脚麻鸡与隐性白鸡杂交后自交的F2代个体的全净堂重、全净堂率、脂肪宽带、腹脂重和腹脂率6个胴体性状,检测10个微卫星DNA标记,对标记基因型胴体性状值进行方差分析和多重比较,结果表明:MCW328对于10周龄体重和全净膛重两性状各基因型均有显著的差异(P<0.05);ADL292对于腹脂重性状各基因型有极显著的差异(P<0.01),对于腹脂率有显著的差异(P<0.05)。MCW328标记基因与控制10周龄体重和全净膛重QTL连锁,ADL292标记基因与控制腹脂重和腹脂率QTL连锁。     

S1核酸酶突变检测法的优化

优化了S1核酸酶突变检测体系,结果表明(1)扩增法比杂交法产生异源双链DNA更节省时间;(2)PCR产物可以直接作为突变检测的底物;(3)适当降低反应温度、适当增加反应缓冲液中的NaCl浓度、适当缩短反应时间可提高突变检测效果。