鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定

为获得针对鲤春病毒血症病毒(SVCV)特异性的单克隆抗体(MAb),以纯化的SVCV为抗原,免疫BALB/c小鼠.将免疫鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,采用间接ELISA法筛选获得4个能稳定分泌抗SVCV MAb的杂交瘤细胞株;4个杂交瘤细胞制备腹水的MAb效价为1:160 000～1:640 000.亚型鉴定结果表明,这些MAb分属2个亚型(1F1、3E1,IgG2a;3F5、4F9,IgGl),轻链均为K链.Western blot分析显示,MAb1F1、3F5、4F9能特异性地识别SVCV的N蛋白(47 ku),3E1能特异性地识别SVCV的G蛋白(69 ku).采用相加ELISA法对抗原表位分析结果显示,1F1、3F5、4F9可能识别相同的表位,3E1则识别不同的表位.间接免疫荧光试验结果显示4株MAb均能对染毒病灶产生特异性的荧光染色.这些MAb的制备为SVCV免疫学检测方法的建立奠定了基础.     

鲤浮肿病毒荧光RAA快速检测方法的建立

为建立一种简单、快速的鲤浮肿病毒(CEV)重组酶介导的链替换扩增(RAA)检测方法,本研究通过比较分析CEVP4a基因序列,设计引物与探针,经过筛选优化,建立了实时荧光RAA检测方法。结果显示,该方法在39℃恒温反应20min即可快速、特异性地检测出CEV,与常见的鱼类病毒不发生交叉反应,其对质粒标准品的检测下限为2.8×10^1拷贝/μL,组内和组间变异系数均小于5%。利用本研究建立的方法对35份临床鲤科鱼类样品进行检测,检测结果与荧光定量PCR方法结果一致。本研究建立的检测方法操作简单,特异性强、敏感性高,结果可靠,不依赖于复杂的仪器,适用于现场对CEV的快速检测。     

我国水产苗种产地检疫存在问题及对策

为规范水产苗种产地检疫,2011年3月17日,农业部关于印发《鱼类产地检疫规程（试行）》等3个规程（以下简称规程）的通知,我国水产苗种产地检疫进入了实施阶段,然而,已经落后陆生动物的产地检疫30多年。我国的苗种的产地检疫,主要依托水产技术推广、水产病害防治中心（水生动物防疫站）和水产研究所等单位开展。对此,各地党政领导重视程度、机构设置与管理及养殖水平、防疫水平、地理位置、经济实力等方面存在较大差异。本文针对产地检疫中行政管理、监督执法和技术服务三位一体存在的问题,谈谈开展水产苗种产地检疫的对策。     

不同生长时期凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的检出与病原鉴定

随着集约化生产、养殖环境恶化,急性肝胰腺坏死病(AHPND)成为了当前制约对虾养殖效益的主要疾病之一。本试验以凡纳滨对虾不同生长时期的亲虾、虾苗、成虾作为研究对象,将对虾的肝胰腺进行初步富集后,采用荧光PCR和普通PCR的方法,检测样品中pirA^VP和pirB^VP毒素基因;对虾苗AHPND的病原进行分离鉴定、药敏试验和动物致病性试验。结果显示,在116份样品中检测到亲虾AHPND阳性3份,虾苗AHPND阳性7份,成虾AHPND阳性9份;从虾苗AHPND样品中分离纯化获得1株弧菌,经生化鉴定为副溶血性弧菌;16S rRNA系统发育树分析显示,该分离株与副溶血性弧菌聚为一类。药敏试验结果显示,该分离株对头孢西叮、头孢呋辛、复方新诺明等11种抗菌药敏感,对头孢噻吩耐药,对阿米卡星中介。动物致病性试验结果显示,健康凡纳滨对虾浸染1.8×10⁸ CFU/mL浓度的副溶血性弧菌菌液后,24 h内全部死亡,对虾的肝胰腺小管上皮细胞出现萎缩、变性、坏死等特征。本试验进一步掌握目前粤西地区不同生长时期凡纳滨对虾中AHPND的流行病学数据和...     

鱼病毒性神经坏死病病毒（VNNV）不同基因型鉴别方法的建立及在VNN检疫和监测中的应用

从GenBank中查找出乙型野田村病毒组中海水鱼类各病毒的序列,并用Sequencher多重序列比较软件将其分到条纹踢神经坏死病毒(striped jack nervous necrosis virus,SJNNV)组、条纹星鲽神经坏死病毒(barfin flounder nervous necrosis virus,BFNNV)组、红点石斑鱼神经坏死病毒(redspotted grouper nervous necrosis virus,RGNNV)组和虎斑东方纯神经坏死病毒(tiger puffer nervous necrosis virus,TPNNV)组4个基因型的组别中。用DNAsis序列比较软件比较同一基因型各基因序列之间的同源性,均在815％以上;不同基因型之间序列的同源性,均在66％以下。结合Premier引物设计软件和Sequencher序列多重比较软件,设计了4对引物,采用逆转录聚合酶链式反应(RT—PCR)来鉴别这4个不同的基因型。对从深圳口岸进境的产地为台湾的海水鱼苗和广东、福建两省养殖的主要海水鱼类进行检疫和监测,结果在进境的海水鱼苗中检出有RGNNV基因型的VNNV,在福建和广东省养殖的石斑鱼成鱼和鱼苗的病鱼体内均检测到RGNNV基因型的VNNV,对上述扩增产物基因序列进行比较,相似性均在96．5％以上,推导出的氨基酸序列与玛拉巴石斑鱼神经坏死病毒(MNNV)序列相似性均为100％。     

加拿大开展兽医体系效能评估的做法及启示

在“同一健康”倡议下,世界动物卫生组织（WOAH）构建了兽医体系效能（PVS）评估标准框架,通过在全球范围内大力推广PVS评估工作,持续加强各成员兽医机构能力建设,实现全球动物卫生、动物福利及公共卫生状况的整体改善。加拿大是WOAH成员中为数不多的,较早申请完成PVS专家评估并公开发表评估报告的发达国家之一,以卓越的表现充分展示了其世界领先水平的兽医服务能力。加拿大开展PVS评估的经验做法包括：运用WOAH PVS评估标准理念开展内部评估,通过查找、分析与既定目标或国际标准的差距,实现重点职能领域核心能力的定向提升;通过主动申请WOAH专家评估,紧密结合全球发展战略和自身需求,确定优先改进和发展事项。这些做法启示我国：应聚焦核心能力建设,构建科学适用的内部效能评估体系;加强交流协作,建立国家层面的跨部门效能评估协调机制;推动联合共治,在重要口岸城市开展联合效能评估试点工作。本文为我国引进、推广PVS评估系统方法,以效能评估为抓手,分步、有序促进国门生物安全核心能力建设,提升体制机制效能提供了借鉴。     

中国南部养殖石斑鱼“肿胀病”的研究

1998年5月至7月间,在中国南部养殖石斑鱼暴发"肿胀病",引起石斑鱼大量发病、死亡.从体表和鳍条的溃疡病灶处分离出2个菌株.形态学观察和生化试验结果表明这2个菌株均为鳗弧菌.将肝、脾、心和肾的上清液接种到CO、FHM、CAB、CK、PG和PC细胞上,没有观察到细胞病变.患病鱼的腹腔中有大量黑色的球状物和腹水,使患病鱼呈现明显的腹部肿胀的症状.组织病理学观察结果表明,这些黑色的球状物由多核细胞组成的增生性组织.     

鲤春病毒血症病毒基质蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备

根据鲤春病毒血症病毒(SVCV)基因组序列(GenBank:NC_002803),人工合成M基因开放阅读框序列,克隆至原核表达载体pET-32a(+),转化工程菌株BL21 (DE3),在0.1 mmol·L-1 IPTG、37℃下诱导5h,获得高效表达的M蛋白,但其主要以包涵体的形式存在,经超声破碎、包涵体纯化后,再...     

病毒性出血性败血症病毒液相芯片检测技术的建立

为建立检测病毒性出血性败血症病毒（VHSV）的液相芯片快速检测技术,用DNAStar软件对GenBank中VHSV的G基因进行序列分析,设计VHSV特异性引物并标记生物素。探针氨基化修饰并与荧光编码微球偶联后与VHSV RT-PCR产物杂交反应,用液相芯片仪器检测荧光信号。结果表明液相芯片检测体系能够正确检出VHSV。病毒核酸的最低检出量为10pg,检测特异性高,说明初步建立了检测VHSV的液相芯片技术,为VHSV的检测提供了新方法。     

基于环境DNA的进口凡纳滨对虾携带水传播虾肝肠胞虫风险评估

【目的】基于环境DNA（eDNA）分析进口凡纳滨对虾携带水传播和运输虾肝肠胞虫（EHP）的风险性,为环境水中疫病监测和风险评估提供参考依据。【方法】取60批进口亲虾携带水用0.45 μm硝酸纤维素膜过滤并提取eDNA,挑取10个携带水样滤膜eDNA用于凡纳滨对虾物种特异性鉴定,采用实时荧光定量PCR对所有携带水样滤膜进行EHP检测;同时以EHP阳性进口亲虾携带水开展人工感染试验,感染10 d后分别取养殖水样及虾体进行EHP检测;对进口亲虾携带水EHP阳性滤膜进行宏基因组测序分析,采用Krona对物种注释结果进行可视化展示,并将宏基因组测序分析结果与NCBI已公布的EHP氨基酸序列进行BLAST比对分析。【结果】进口亲虾携带水检测结果显示,成功从10个携带水滤膜eDNA扩增出凡纳滨对虾347 bp的特异目的片段,与原始序列片段的相似性达100%;在60批进口亲虾携带水样品中有2批携带水呈EHP阳性。EHP阳性进口亲虾携带水能成功感染虾苗组,且在虾苗肝胰腺组织分离获得成熟的EHP孢子,但亲虾组的虾体EHP检测呈阴性。宏基因组测序得到EHP的物种相对丰度值占真核动物物种的0.7%;与NCBI已公布的EHP氨基酸序列进行BLAST比对,结果获得213个同源EHP氨基酸序列;从进口亲虾携带水样品中分离鉴定获得的EHP与已报道物种黄道蟹肠孢虫（Enterospora canceri）和毕氏肠胞虫（Enterocytozoon bieneusi）的亲缘关系较近,对应的氨基酸序列相似性为别为83%和81%。【结论】进口凡纳滨对虾亲虾携带水具有传播EHP的可能性,即仅针对亲虾虾体进行EHP检测具有不完全性。eDNA检测可用来补充传统的虾体疫病监测方法,作为水环境疫病检测和风险评估的重要手段。