间接免疫组化法检测鸭疫里默氏杆菌感染和抗原定位

应用鸭源血清1型鸭疫里默氏杆菌(RA)作为抗原。免疫兔制备兔抗RA的IgG。建立了检测雏鸭感染鸭疫里默氏杆菌的间接免疫酶组织化学法。该法检测大肠杆菌(O1、O8、O79、O138)、鸭沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌(5：A)感染发病死亡雏鸭组织。不出现阳性反应，而检测RA感染发病死亡雏鸭组织出现特异性阳性反应；检测RA人工发病死亡雏鸭。可在心脏、肝脏、肺脏、肾脏、十二指肠、盲肠、直肠、脾脏、法氏囊、胸腺、胰脏、脑和腺胃检测到RA抗原，RA抗原分布于细胞浆、组织间隙和血液；检测RA人工感染病例与RA肝脏分离符合率为100％，检测临床可疑病例的血清1型RA的阳性率(92．96％)比细菌分离率(75.12％)高。该法具有特异、直观和敏感的特点，可用于雏鸭RA人工感染和临床感染的诊断、检测及RA抗原定位和RA致病机理的研究。     

黑龙江省鸭肝炎病毒HD—Ⅰ株的分离与鉴定

从黑龙江省某鸭场疑似鸭病毒性肝炎(DVH)的发病雏鸭肝等组织中分离到1株病毒HD—Ⅰ株。经病理学检查、电镜观察、鸭胚中和试验、雏鸭保护试验、动物回归试验等鉴定为血清Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV)。证实引起该鸭场雏鸭发病和死亡的主要原因为DVH所致。用DHV标准R85952毒株多次强化免疫健康鸡，获得高效价的鸡抗鸭肝炎超免疫抗体。     

间接免疫酶组织化学法检测雏鹅感染鸭疫里默氏杆菌的研究

应用鹅源血清1型鸭疫里默氏杆菌(RA)作为抗原免疫兔制备兔抗RA的IgG，建立了检测雏鹅感染鸭疫里默氏杆菌的间接免疫酶组织化学法(Indirect Immunoperoxidase Staining，IIS)，该法与大肠杆菌（O1、O8、O79、O138)、鸭沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌(5：A)感染发病和死亡雏鹅组织不出现阳性反应而与RA感染发病死亡雏鹅组织出现特异性阳性反应。RA人工发病死亡雏鹅可在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、回肠、直肠、肺脏、十二指肠、空肠和盲肠检测到RA抗原，RA抗原分布于细胞胞浆、组织间隙和血液，检测RA人工感染病例与RA肝脏分离符合率为100％，检测临床可疑病例的血清1型RA的阳性率(92.96％)比细菌分离率(75．12％)高。该法具有特异、直观和敏感的特点，可用于雏鹅RA人工感染和临床感染的诊断、检测及RA感染雏鹅后抗原定位和RA致病机理的研究。     

鸭肝炎病毒对雏鸭肝组织中MDA和GSH-PX的影响

对雏鸭分别感染弱毒株、中毒株、强毒株肝炎病毒后，在ld、3d、5d、7d分别测定对照组和实验组肝组织中丙二醛(MDA)的含量和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH—Px)的活性。结果表明，雏鸭感染鸭肝炎病毒(DHV)后肝组织中MDA含量和GSH—Px活性发生明显变化，其中，实验组在5d时MDA含量显著增多，而GSH—Px的活性明显降低。结果提示，自由基参与了鸭病毒性肝炎(DVH)发生发展的致病过程，在DHV诱导的细胞凋亡过程中自由基可能起关键作用。     

免疫酶组化法对试验感染雏鸭体内鸭肝炎病毒的分布测定

鸭病毒性肝炎（Duck Virus Hepatitis，DVH）是雏鸭的一种传播迅速、病程短和高度致死性的传染病，主要病变是肝脏肿大和肝脏表面有出血点或出血斑。本病白1945年Levine和Hofstad发现以来，现已呈世界性分布。本试验以鼠抗DHV抗体为一抗，HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗，建立了检测石蜡切片中DHV抗原的免疫酶组化法，并以此对人工感染雏鸭不同组织器官中的DHV精确定位和分布测定，为探讨鸭病毒性肝炎致病机理研究提供依据。     

鸭病毒性肝炎的病原分离和鉴定

从间接免疫荧光检测呈DVH阳性的病死鸭肝脏分离到3株(CD、HB、XC)病毒,电镜下病毒颗粒呈圆形、无囊膜,直径30～40nm,对氯仿、pH3.0、50℃,60min的处理不敏感,分离毒连续传代3次,全部鸭胚在24～60h死亡,胚体呈弥散性充血、出血,其致死鸭胚的能力能够被Ⅰ型DHV高免血清中和。分离毒人工感染1日龄雏鸭后出现与自然病例相同的临床症状和病理变化,并能重新分离到相同病毒。间接免疫组化检测自然病例和人工感染雏鸭的肝、脾、肾等均呈现DVH阳性。结果表明分离到的3株病毒均为Ⅰ型DHV,为有效预防DVH提供了有用的实验数据。     

应用RT-PCR检测鸭肝炎病毒Ⅰ型感染

鸭肝炎病毒Ⅰ型(duck hepatitis virus Ⅰ,DHV Ⅰ)感染是雏鸭的一种急性高度致死性传染病,主要侵害4周龄以内的雏鸭,特别是1周龄以下的雏鸭最易感染,死亡率较高,是危害养鸭业最为严重的传染病之一[1].1945年在美国首次发现,我国于1963年在上海首次报道了该病的临床病例,至今,全国各养鸭地区均有不同程度的发生和流行.目前,已有多种检测DHV Ⅰ抗原的方法,如免疫电镜、Dot-ELISA和病毒中和试验等,这些方法在DHV Ⅰ的诊断中各有优势.PCR作为一种新的分子生物学检测技术,具有灵敏度高、快速、特异、操作简单等优点[2～4].本实验通过目前已发表的DHV Ⅰ基因组序列相对保守的区域设计引物,成功建立了RT-PCR方法检测鸭肝炎病毒1型.     

雏鸭肝炎病毒感染后鸭CD8α基因及其通路相关基因表达变化

本研究旨在了解雏鸭肝炎病毒感染后鸭CD8α基因及其通路相关基因表达变化。通过对3日龄无母源抗体的金定鸭雏鸭感染雏鸭肝炎病毒(DHV),构建雏鸭肝炎感染实验动物模型,对雏鸭肝炎病毒发病组、未发病组和对照组的胸腺、肝脏、脾脏、肺、肾脏、大脑、小脑等组织CD8α基因及其信号通路上MHCⅠ、MHCⅡ、TNF-α等基因进行RT-qPCR检测。结果表明:在攻毒组(发病组和未发病组)扩增出DHV 3D基因的保守区域特异性条带,表明成功构建了雏鸭肝炎感染模型CD8α基因,RT-qPCR结果显示,CD8α、MHCⅠ和MHCⅡ基因在发病组各组织表现为不同程度的下调,在未发病组表现为不同程度的上调;而TNFα在发病组和非发病组的肝、脾、肺和肾等组织中表现为不同程度的上调。研究揭示了雏鸭肝炎病毒感染后CD8α基因及其通路相关基因表达变化,其结果有助于更好地了解duCD8α基因在细胞免疫中表达调控作用。     

间接酶免疫组化检测DPV在感染鸭体内细胞定位的研究和应用

以超速离心浓缩结合蔗糖密度梯度离心法提纯的鸭瘟病毒（DPV）作为抗原免疫家兔制备兔抗DPV血清,用饱和硫酸铵沉淀结合DEAE-Sephedax-A-50离子交换柱层析提纯兔抗DPV IgG,建立了检测甲醛固定鸭体组织石蜡切片上DPV抗原的间接酶免疫组化法。该法能特异地检测出DPV感染鸭组织中的DPV而对鸭疫里默氏菌、鸭源多杀性巴氏杆菌（5∶A）、鸭源大肠杆菌（O1）感染致死的鸭组织以及正常鸭组织呈阴性反应,检测DPV感染死亡鸭的肝、十二指肠、脑、脾和胸腺的结果与PCR检测结果相同。其敏感性高于原位杂交。对DPV CH强毒株人工感染致死鸭的检测结果表明,该法可特异检测到肝、肺、肾、脑、十二指肠、空肠、回肠、直肠、法氏囊、脾脏、腺胃以及食管中的DPV。DPV主要分布于这些器官的上皮细胞和巨噬细胞。对1992-2004年经10%福尔马林保存的鸭瘟临床病例的肝脏检测结果均为阳性。该法可用于DPV感染鸭的诊断和定位检测,也可用于对甲醛固定组织进行回顾性诊断检测。     

新型鸭呼肠孤病毒和鸭肝炎病毒混合感染的诊断及病原分离

广东某养鸭场番鸭发生疑似雏鸭肝炎急性死亡病例。为了确诊病因,取病鸭肝脾等组织进行实验室检测和病原分离鉴定,结果显示:病鸭肝脾组织,冰冻切片免疫荧光检测番鸭源鹅细小病毒(MDGPV)和番鸭细小病毒(MPV)阴性;RT-PCR检测鸭肝炎病毒(DHV)和新型番鸭呼肠孤病毒(NDRV)为阳性。将肝脾匀浆上清接种12日龄番鸭胚后3日死亡,进一步应用RT-PCR和免疫荧光法检测胚液和死胚胚心,结合扩增基因的测序、动物回归试验等,确诊发病鸭为NDRV和DHV的混合感染。     

新型鸭肝炎病毒流行病学调查及免疫防治试验

本试验通过鸭胚尿囊腔接种，对我国部分省市采集的死于疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织进行病原分离，获得9个病毒分离株。这些分离株对10日龄鸭胚的致死率为100％，人工感染6日龄雏鸭的致死率为0～100％不等。死亡鸭呈角弓反张姿势，剖检可见肝脏肿大，有出血点或出血斑。将9株分离株经鸭胚传至第5代，收集鸭胚尿囊液毒测定这些毒株的ELD50为10^-7.32／0．2ml～10^-3.5／0．2ml不等。用鸡抗1型DHV及新型DHV的血清进行中和试验，结果表明：有7株为新型DHV，有2株为1型DHV。对实验室早期分离的新型鸭肝炎病毒B株经过鸭胚传代致弱后，收集鸭胚尿囊液毒稀释成不同倍数对1日龄雏鸭进行免疫，并于10日龄时用新型鸭肝炎强毒进行攻毒保护试验，结果B20株在20倍稀释时，保护率达100％。采集免疫的雏鸭血清，中和试验测定血清的效价，雏鸭在免疫后可检测到中和抗体，第10天时抗体水平达到高峰，然后呈逐渐下降趋势。结果表明，B株经过鸭胚传代致弱后在毒力下降的同时仍保留一定的免疫原性．可以作为疫苗的候选株。     

鸭病毒性肝炎研究进展

鸭病毒性肝炎是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭的一种传染病,具有发病急、传播迅速、病程短、病死率高等特点,临床上主要表现为食欲减退、神经症状、突然死亡和肝脏肿大出血.病原有3种,其中Ⅰ型鸭肝炎病毒在世界范围内流行,Ⅱ型和Ⅲ型鸭肝炎病毒分别局限于英国和美国.不同血清型毒株具有不同的理化和生物学特性,且无免疫交叉反应.近年来国内外报道了Ⅰ型鸭肝炎病毒的变异株,且已完成了病毒基因组的测序工作,并随之出现RT-PCR诊断技术,对雏鸭病毒性肝炎的诊断和防控具有重要意义.     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立

根据获得的Ⅰ型鸭病毒性肝炎病毒（DHVⅠ）RNA聚合酶基因序列，应用Primer Premier5．0软件设计了1对引物，建立了检测DHVⅠ的RT-PCR方法。该法能从DHVⅠ中扩增到440bp的条带，而对正常鸭胚尿囊液、健康鸭肝、鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、鹅细小病毒、雏鹅新型病毒性肠炎病毒、禽流感病毒（H5N2亚型）、鸭病毒性肿头出血症病毒、鸭源多杀性巴氏杆菌（5：A）的扩增结果均为阴性。该法最低可以检测到30pg的DHV工核酸模板。RT-PCR对DHVⅠ强毒CHv-1株人工感染发病死亡鸭肝的检测结果与病毒分离和Dot—ELISA检测结果的阳性检出率均为100％，对脾、肺、脑病料的检出率显著（P≤0．01）高于病毒分离和Dot-ELISA。RT-PCR、病毒分离和Dot—ELSA对1987～2005年采集且保存于-20℃的经病毒分离已确诊为鸭肝炎的临床送检肝病料的检出率分别为100％（19／19）、36．84％（7／19）和57．98％（11／19），对2000-2005年采集且于-20℃保存的来源于中国18个省份发病鸭群的48份肝病料的检出率分别为100％（48／48）、56．25％（27／48）和75．00％（36／48）。结果表明，建立的RT—PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于DHVⅠ的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

间接血凝试验检测鸭肝炎病毒抗体的研究

粗提DHV经Sephadex G200柱层折纯化后作为致敏用抗原,戊二醛法固定绵羊红细胞、BDB法致敏抗原红血球,建立了检测DHV抗体的间接血凝试验,其最佳致敏条件为:50%醛化红血球0.1ml、BDB2ml、DHV抗原0.5mg、37℃15min。本试验还对不同鸭血清的IHA抗体及免疫雏鸭的抗体水平等进行了检测,经与中和试验比较,阳性结果符合率为84.6％。     

鸭肝炎病毒的分离、鉴定及鸡抗高免卵黄抗体的制备

鸭病毒性肝炎是鸭肝炎病毒(DHV)引起的雏鸭急性传染病,尤其是1～2周龄的雏鸭发病率和死亡率较高。1材料材料有疑似Ⅰ型鸭肝炎病毒病料、Ⅰ型鸭肝炎病毒标准毒株、抗Ⅰ型鸭肝炎病毒阳性血清、Ⅰ型鸭肝炎病毒弱毒苗、Ⅰ型鸭肝炎病毒油乳剂灭活苗。9日龄非免疫鸡胚。     

一株鸭病毒性肝炎病毒的分离与鉴定

鸭病毒性肝炎 (Duck viral hepatitis,DHV)是雏鸭的一种高度致死性的病毒性传染病,以发病急、传播快、病程短、死亡率高为主要特征[1].目前,已有多种检测DHV Ⅰ抗原的方法,如免疫电镜、Dot-ELISA和病毒中和试验等,这些方法在DHVⅠ的诊断中各有优势[2].     

Ⅰ型鸭肝炎病毒变异株的鉴定

鸭病毒性肝炎是雏鸭的一种高度致死性传染病,其特点是发病急、病程短、传播快、死亡率高,死亡鸭多呈角弓反张,其肝脏常有特征性的出血性病变.鸭肝炎病毒（duck hepatitis virus, DHV）是本病病原,目前归属于小RNA病毒科的未确定种,DHV分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,其中Ⅰ型呈世界范围分布,Ⅱ型仅限于英国,Ⅲ型则限于美国.DHV还存在一类毒株,与Ⅰ型仅有部分血清学相关性,Sandhu等（1992）称之为Ⅰ型的变异株,命名为Ⅰa型。     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎研究进展

鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭一种高度致死、高度传播性的病毒性传染病.该病以肝炎为主要特征,具有高发病率和高病死率.DHV分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型,3个型之间无交叉保护作用.Ⅰ型DHV呈世界性分布,并常和其他病毒、细菌混合感染,严重影响了养鸭业,造成了巨大的经济损失.文章对Ⅰ型DVH病原学、致病机理、分子生物学诊断技术和防控等方面进行了综述.     

人工感染鸭肝炎病毒对雏鸭肝组织的损伤作用

用不同毒力的鸭肝炎病毒（DHV）感染雏鸭，在感染后第1，3，5和7d分别测定对照组和试验组雏鸭肝组织丙二醛（MDA）含量和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px)活性。结果表明，试验组在人工感染后第5d MDA含量显著升高，丙GSH－Px活性明显降低，提示自由基参与了鸭病毒性肝炎（DVH）的发生发展过程，在DHV诱导的细胞凋亡过程中自由基可能起着关键性作用。     

鸭坦布苏病毒对雏鸭免疫系统的影响

为研究鸭坦布苏病毒(DTMUV)对雏鸭免疫系统的影响,本试验对5日龄雏鸭静脉接种DTMUV,并于接种后不同时间取雏鸭脾脏、胸腺、法氏囊进行组织病理学、抗原和凋亡检测。结果显示,DTMUV感染雏鸭的脾脏、胸腺、法氏囊均严重受损。接种DTMUV后4d,脾脏淋巴细胞减少,胸腺可见严重细胞崩解和大面积坏死区域,法氏囊滤泡轻度萎缩;接种后6d免疫器官病变最为严重,其中胸腺静脉严重栓塞,淋巴细胞变性坏死,空泡化也更加严重;接种后8d免疫器官病变均有所减轻,至16d,免疫器官结构基本恢复正常。通过免疫组织化学方法在感染雏鸭的脾脏、胸腺、法氏囊中均检测到DTMUV抗原;细胞凋亡试验显示DTMUV能够显著引起脾淋巴细胞凋亡。综上所述,DTMUV可严重损伤雏鸭免疫器官,且这种损伤常发生于感染早期,并于感染后8d出现好转。