整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中的表达与定位

旨在探究整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位的表达差异,为进一步了解整合素αv在牦牛生殖过程中发挥的作用提供理论依据。本研究采集卵泡期、黄体期和妊娠期健康母牦牛（3~6岁）的输卵管伞部、壶腹部和峡部样品,将卵泡期、黄体期和妊娠期输卵管分别按照伞部、壶腹部和峡部分为9组,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白免疫印迹法（Western-blotting,WB）检测整合素αv基因和蛋白的表达情况,运用免疫组织化学法检测整合素αv的定位。结果表明：1）qRT-PCR结果显示,在卵泡期,整合素αv基因在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）;在黄体期,整合素αv基因在输卵管峡部的表达量最高,极显著高于伞部和壶腹部（P<0.01）;在妊娠期,整合素αv基因在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）。2）Western-blotting结果显示,在卵泡期,整合素αv蛋白在输卵管伞部的表达量最高,极显著高于壶腹部和峡部（P<0.01）;在黄体期,整合素αv蛋白在输卵管峡部的表达量最高,极显著高于伞部和壶腹部（P<0.01）;在妊娠期,整合素αv蛋白在输卵管峡部和伞部的表达差异不显著,但二者极显著高于壶腹部（P<0.01）。3）免疫组织化学结果显示,整合素αv主要分布于输卵管伞部、壶腹部和峡部的纤毛细胞、分泌细胞、基细胞、肌层和浆液腺中。结果显示,整合素αv在牦牛繁殖周期输卵管不同部位中的表达存在显著差异,说明其可能参与了牦牛受精及早期胚胎发育等一系列生殖过程,为牦牛的繁殖性能研究提供了基础资料。     

HIF-1α和IL-17在牦牛、犏牛及黄牛睾丸中的表达比较研究

本研究旨在比较HIF-1α和IL-17在不同牛睾丸组织中的差异性表达,进一步探究HIF-1α与IL-17在牛睾丸组织中发挥调控功能的关联性。以成年牦牛、犏牛和黄牛的睾丸作为研究对象,采用Western-blot、实时荧光定量PCR法检测HIF-1α及IL-17蛋白和基因在3种牛睾丸组织的表达差异。结果显示,3种牛睾丸组织中HIF-1α与IL-17基因和蛋白表达都存在显著性差异,且在犏牛睾丸组织中的表达均极显著高于牦牛和黄牛（P<0.01）;此外,牦牛HIF-1α与IL-17蛋白水平表达显著高于黄牛（P<0.05,P<0.01）,而牦牛IL-17基因水平表达与黄牛差异不显著（P>0.05）。HIF-1α和IL-17基因和蛋白在不同牛睾丸组织中的表达差异说明其具有种属特异性;而牦牛和犏牛睾丸组织中显著性高表达提示HIF-1α和IL-17对适应低氧环境具有重要的调节作用。     

miR-138靶向PGC-1α调控牦牛肌内前体脂肪细胞增殖及分化

旨在分析miR-138在牦牛前体脂肪细胞分化过程中的调控作用。本研究设计合成miR-138 mimics和inhibitor以对细胞进行miR-138过表达及抑制表达,并通过油红O染色分析miR-138对牦牛肌内前体脂肪细胞脂质沉积的影响;利用CCK-8、划痕和流式细胞技术分析miR-138对细胞增殖的影响;通过对bta-miR-138进行生物信息学分析,筛选其在脂质沉积过程中的相关潜在靶基因;利用RT-qPCR测定miR-138潜在靶基因mRNA表达水平,并通过双荧光素酶报告试验确定靶向关系。结果显示,过表达miR-138后,细胞内脂滴沉积水平显著低于对照（NC）组（P<0.01）,而抑制miR-138表达则显著增强脂肪细胞脂质沉积（P<0.01）;RT-qPCR结果表明,过表达miR-138可显著抑制脂肪分化标志基因PPARγ和c/EBPα的表达（P<0.01）,抑制miR-138则上调PPARγ和c/EBPα表达水平（P<0.05）;此外,过表达miR-138后,潜在靶基因PTPN11、CREB1和ADCYAP1R1表达水平显著下调（P<0.05）,而PGC-1α和SNAP25表达极显著下调（P<0.01）;抑制miR-138后MXLIP和SNAP25表达显著上调（P<0.05）,PGC-1α和PTPN11表达极显著上调（P<0.01）;CCK-8和划痕试验结果表明,过表达miR-138后24~36 h,细胞增殖活性显著低于对照组（P<0.05）,而抑制miR-138则表现为细胞增殖活性增强;流式分析结果显示过表达miR-138后,细胞出现G1-S期阻滞,细胞周期相关基因CCND1、CCNB1和增殖标志基因Ki67的mRNA表达显著降低;生物信息学分析预测获得263个miR-138公共靶基因,KEGG富集结果显示靶基因主要参与“轴突导引”、“胰岛素抵抗”、“胰岛素分泌”及“RNA降解”等通路,GO分析主要富集于“RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控”、“核染色质”、“染色质DNA结合”和“I型肺细胞分化”等功能;双荧光素酶报告试验结果显示,共转染miR-138 mimics和PGC-1α-Wt-PGL3-basic可显著降低细胞荧光强度（P<0.01）。以上结果表明,miR-138可通过靶向结合PGC-1α 3'UTR序列,降低PGC-1α的mRNA表达水平,抑制牦牛肌内前体脂肪细胞分化和脂质沉积,降低细胞增殖活性。本研究为阐明牦牛肉质性状的潜在分子机制提供参考。     

脑红蛋白和缺氧诱导因子-1α在牦牛后脑的表达与定位研究

脑红蛋白（neuroglobin，NGB）和缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是存在于脊椎动物神经系统中的两种关键性神经保护因子，在低氧适应过程中具有重要的生理功能。为探究牦牛（Bos grunniens）脑组织中对机体运动、呼吸、感觉等生理活动起重要调节作用的后脑在适应低氧过程中NGB和HIF-1α的表达与分布关系，本研究利用RT-qPCR、Western blot及免疫组织化学技术，对NGB和HIF-1α在牦牛后脑不同区域的表达与定位特征进行了研究。RT-qPCR和Western blot结果显示，牦牛后脑中，NGB和HIF-1α基因与蛋白表达趋势基本一致，在小脑蚓前叶中的表达量最高，并显著高于延髓、脑桥及小脑其他部位（P<0.05），小脑半球皮质次之（P<0.05），蚓小叶表达量最低，其他不同区域间两种因子的表达量也存在一定差异。免疫组化结果显示，NGB和HIF-1α阳性产物分布特征相似，且HIF-1α蛋白免疫阳性反应的整体强度高于NGB蛋白。各区域NGB和HIF-1α主要散在表达于特定层次的神经元胞质中，如延髓、脑桥神经元，小脑半球、蚓部皮质分子层、浦肯野细胞层及颗粒层神经元等。小脑半球髓质区的神经胶质细胞内也见有少量NGB和HIF-1α阳性表达，阴性对照均无表达。上述结果提示，牦牛后脑不同区域NGB和HIF-1α的表达在长期适应低氧环境过程中存在一定的选择性差异，蚓前叶对缺氧具有较高的耐受性，小脑半球皮质次之，蚓小叶的缺氧耐受性最弱，这种差异的产生可能与后脑相关区域承担的特定功能有关联，但其具体机制尚有待进一步探讨。各区域低氧适应性功能的发挥主要依赖其特定的神经元结构。     

MCU在低氧诱导肉鸡心肌细胞线粒体损伤中的作用

旨在探讨线粒体钙单向转运体（mitochondrial calcium uniporter,MCU）介导线粒体Ca²⁺转运是否参与低氧诱导的肉鸡心肌细胞线粒体损伤。试验通过分离白羽肉鸡鸡胚原代心肌细胞,在低氧条件下（3% O₂,5% CO₂,92% N₂）培养24、48、72 h,同时使用RU360抑制MCU的表达并在低氧条件下处理72 h后,使用流式细胞术检测细胞内Ca²⁺浓度、线粒体Ca²⁺浓度、线粒体活性氧水平和线粒体膜电位,检测MCU及其调节因子的mRNA和蛋白表达。结果显示,通过差速贴壁方法培养的心肌细胞纯度可达90%以上;低氧培养24 h,诱导心肌细胞MCU、MICU1 mRNA表达增加（P<0.05）,胞浆和线粒体内Ca²⁺浓度显著上升（P<0.05）,线粒体膜电位增加（P<0.05）;低氧培养48 h,诱导MCUR1和MICU1 mRNA表达减少（P<0.05）,细胞Ca²⁺浓度上升（P<0.05）;低氧培养72 h,诱导MCU mRNA表达增加（P<0.01）,细胞和线粒体内Ca²⁺增加（P<0.01）,线粒体膜电位下降（P<0.01）,活性氧增加（P<0.01）。低氧处理72 h后,与低氧组相比,RU360预处理组细胞和线粒体内Ca²⁺减少,线粒体膜电位上升,活性氧生成减少（P<0.01）,MCU mRNA表达减少（P<0.01）。结果表明：低氧诱导MCU上调导致线粒体钙超载,促使线粒体功能降低并发生损伤,进而心肌细胞发生损伤;抑制MCU表达可以减轻低氧诱导的心肌细胞线粒体钙超载,保护线粒体。     

烟碱对LPS诱导的兔子宫内膜上皮细胞炎症因子及前列腺素分泌的影响

试验旨在探索α7烟碱乙酰胆碱受体（α7 nicotinic acetylcholine receptor,α7nAChR）的高亲和力激动剂烟碱对脂多糖（lipopolysaccharides,LPS）诱导的兔子宫内膜上皮炎症的作用机制。分离发情后期兔的子宫内膜上皮细胞,用100 ng/mL LPS对细胞进行炎性刺激12 h。用CCK8法检测不同浓度烟碱（5、10和20 μg/mL）对细胞存活率的影响,筛选合适浓度的烟碱进行后续试验。将细胞分为对照组（CON）、LPS、LPS+烟碱、LPS+烟碱+甲基牛扁碱（MLA）（α7nAChR的特异性颉颃剂）组,通过ELISA法检测细胞培养上清液中白细胞介素-1β（interleukin 1β,IL-1β）、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor,TNF-α）、前列腺素E₂（prostaglandin E₂,PGE₂）和前列腺素F_2α（PGF_2α）的含量。试验成功分离兔子宫内膜上皮细胞,且传至第5代仍保持良好的生长状态。CCK8检测结果显示,20 μg/mL烟碱组细胞存活率显著降低（P<0.05）,10 μg/mL烟碱对细胞存活率无显著影响（P>0.05）,所以选择10 μg/mL烟碱进行后续试验。ELISA结果显示,与对照组相比,LPS组IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、PGE₂和PGF_2α的含量显著增加（P<0.05）;与LPS组相比,LPS+烟碱组显著降低IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、PGE₂和PGF_2α的含量（P<0.05）,LPS+烟碱+MLA组炎性因子和前列腺素的含量差异不显著（P<0.05）。以上结果表明,烟碱对LPS诱导的兔子宫内膜上皮细胞分泌IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、PGE₂和PGF_2α具有下调作用,推测烟碱通过α7nAChR介导炎性因子和前列腺素分泌下调而发挥抗炎作用,该结果可为研究α7nAChR作为子宫内膜炎治疗靶点的药物选择提供参考。     

HOTAIR与山羊皮肤黑色素沉积的关系及体外表达规律的研究

旨在探讨山羊HOX转录反义RNA（HOTAIR）及其部分家族基因与山羊皮肤黑色素沉积的关系以及它们在黑色素细胞中的表达规律。本研究采用qRT-PCR检测HOTAIR和HOXD10、HOXC11、HOXC12基因在健康成年雌性酉州乌羊（（19.16±1.44）kg）、板角山羊（（23.27±3.24）kg）皮肤组织中的mRNA水平，及其在小鼠皮肤黑色素瘤细胞（B16-F10）增殖、分化过程中（培养1、3、5和7 d）的表达模式，并分析HOTAIR与其他3个基因表达的相关性。结果显示，在皮肤组织中，酉州乌羊HOTAIR和HOXC12的相对表达量极显著高于板角山羊（P<0.01），酉州乌羊HOXD10的相对表达量显著低于板角山羊（P<0.05）；HOTAIR与HOXC12表达显著正相关（P<0.05），与HOXD10表达显著负相关（P<0.05）。在B16-F10细胞增殖阶段，HOTAIR在各阶段表达差异不显著（P>0.05），HOXC11、HOXC12和HOXD10呈"高-低-高"的表达模式，且均在培养1 d的相对表达量极显著高于3和5 d（P<0.01）；HOTAIR与HOXC11表达呈极显著正相关（P<0.01）。在B16-F10细胞分化阶段，HOTAIR表达持续上升，HOXD10表达持续下降，HOXC11在各阶段的相对表达差异不显著（P>0.05），HOXC12在培养1和5 d的相对表达量极显著高于3和7 d（P<0.01）；HOTAIR与HOXD10表达极显著负相关（P<0.01）。HOTAIR在乌皮山羊皮肤中高表达，在B16-F10细胞分化阶段的表达随着培养时间的延长而增加，HOTAIR对HOXD10存在负向调控作用。HOTAIR与HOXD10互作可能调控山羊皮肤黑色素细胞的分化与黑色素生成。     

猴头菇多糖对MDRV感染RAW264.7细胞TLR3/TRIF诱导表达及病毒复制的影响

试验旨在探究猴头菇多糖（HEP）预处理RAW264.7细胞对番鸭呼肠孤病毒（MDRV）复制的影响及其机制,从Toll样受体3/β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TLR3/TRIF）信号通路解析HEP在调节MDRV所致的雏番鸭机体免疫抑制中的作用机制并提供体外试验参考。试验设空白对照组（BCG）、病毒感染对照组（VCG）、HEP对照组（HCG）和HEP预防病毒感染组（HPG）,RAW264.7细胞在MDRV感染12和24 h后,通过Western blotting检测各组细胞中TLR3、TRIF和肿瘤坏死因子受体相关因子6（TRAF6）的蛋白表达量;病毒感染24 h后,用ELISA法检测各组细胞培养液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-10（IL-10）、IL-6、IL-1β、干扰素-β（IFN-β）的含量。TCID₅₀检测结果表明,MDRV病毒的TCID₅₀为10^3.46。病毒感染后12 h,细胞未出现明显变化;病毒感染后24 h,细胞变圆;病毒感染后36 h,细胞大量死亡。MDRV在RAW264.7细胞中的复制结果显示,在感染病毒12~24 h内,σNS的表达量呈现上升趋势;在24~36 h,σNS的表达量维持在较高水平。Western blotting结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞TLR3、TRIF和TRAF6蛋白的表达量在感染后12和24 h均显著升高（P<0.05）,HCG组TRIF蛋白的表达量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组的σNS、TLR3、TRIF和TRAF6蛋白表达量在病毒感染12和24 h均显著降低（P<0.05）。ELISA检测结果显示,与空白对照组相比,VCG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-β的含量均显著升高（P<0.05）;与感染组相比,HPG组细胞培养液中TNF-α、IL-6、IL-1β含量均显著降低（P<0.05）,IFN-β的含量显著升高（P<0.05）。结果表明,HEP可调节MDRV感染诱导RAW264.7细胞TLR3信号转导通路活化,抑制TLR3信号转导通路下游产物TNF-α、IL-10、IL-6和IL-1β的过度表达,同时上调IFN-β的表达,从而抑制MDRV在RAW264.7细胞中的复制。     

黄芪多糖诱导SOCS3表达对鸡巨噬细胞炎症反应的抑制作用

试验旨在探究黄芪多糖（Astragalus polysaccharide,APS）对LPS诱导的鸡巨噬细胞（HD11）炎症模型的抗炎效果和作用机制。用不同浓度的LPS刺激鸡巨噬细胞（HD11）,通过CCK8法检测细胞活力,实时荧光定量PCR检测白细胞介素-1β（IL-1β） mRNA表达的变化,以确定构建细胞炎症模型的LPS最适添加浓度。将HD11分为对照组（C）、脂多糖（LPS）组（L）、黄芪多糖（APS）组（A）和黄芪多糖抑制脂多糖组（A+L）,在LPS刺激后的2、6、12、24、48 h用实时荧光定量PCR法检测IL-1β、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、核转录因子（NF-κBp65）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和细胞因子信号转导抑制因子3（SOCS3） mRNA表达的变化,Western blotting法检测NF-κBp65、p38MAPK和SOCS3蛋白含量变化,ELISA检测IL-1β和TNF-α蛋白含量变化。细胞活力和IL-1β检测结果表明,构建细胞炎症模型的LPS最适添加浓度为0.5 μg/mL。实时荧光定量PCR结果表明,与对照组相比,L和A组IL-1β、TNF-α、NF-κBp65、p38MAPK和SOCS3 mRNA表达均显著升高（P<0.05）;与L组相比,A+L组在LPS刺激后的IL-1β、TNF-α、NF-κBp65和p38MAPK mRNA表达含量均显著降低（P<0.05）,SOCS3 mRNA表达显著增加（P<0.05）。Western blotting结果表明,与对照组相比,A组P-NF-κBp65/NF-κBp65、P-p38MAPK/p38MAPK和SOCS3/α-tubulin比值均显著增加（P<0.05）;与L组相比,A+L组P-NF-κBp65/NF-κBp65和P-p38MAPK/p38MAPK比值均显著降低（P<0.05）;A+L组SOCS3/α-tubulin比值显著升高（P<0.05）。ELISA结果表明,与对照组相比,L组IL-1β和TNF-α蛋白含量在2~48 h均显著增加（P<0.05）;与L组相比,A+L组IL-1β和TNF-α的蛋白含量在LPS刺激后12~48 h均显著降低（P<0.05）。以上结果表明,在LPS诱导的HD11细胞炎症模型中,APS通过促进SOCS3的表达抑制NF-κBp65和p38MAPK信号通路的过度活化,从而发挥抗炎作用。     

HMGB1与日本血吸虫病肝炎症和纤维化的相关性分析

旨在探究高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1,HMGB1）与日本血吸虫病肝炎症和纤维化的相关性,本研究将BALB/c小鼠随机分为空白对照组（n＝10）,感染后4周组、6周组和HMGB1抑制剂组（n＝5）,进行血常规及生化检测,观察肝病理学及Masson染色情况、荧光定量PCR检测HMGB1、IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ、α-SMA、Col1α1、TGF-β1、Smad2和Smad3的转录水平。结果显示：感染后4周,小鼠谷丙转氨酶（alanine aminotransferase,ALT）、肝组织HMGB1、α-SMA、TGF-β1、IL-6和 TNF-α的转录水平均显著或极显著升高（P<0.05或P < 0.01）;感染后6周,小鼠WBC、Neu、Mon、Eos、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase,AST）和ALT极显著升高（P<0.01）,肝组织HMGB1、IL-1β、TNF-α、IL-6、IFN-γ、α-SMA、Col1α1、TGF-β1、Smad2和Smad3的转录水平均显著或极显著升高（P<0.05或P<0.01）;感染后6周小鼠肝虫卵聚积处伴有炎性细胞浸润和胶原纤维增生;HMGB1抑制剂可显著降低小鼠血清ALT值和肝组织HMGB1、α-SMA、TGF-β1、IL-6和TNF-α的转录水平（P<0.05）。综上表明,HMGB1与日本血吸虫病肝炎症和纤维化具有一定相关性。     

母猪妊娠期不同能量水平对后代公猪生长性能、睾丸发育与免疫的影响

试验旨在研究母猪妊娠期能量水平对后代睾丸发育与免疫的影响及其作用机理。选取30头体重、背膘相近的7~9胎长白×约克夏（LY）经产母猪,按照体重和胎次随机分为2组,每组15个重复,每个重复1头母猪,从妊娠当天分别饲喂正常能量（CON）和低能量饲粮（LE,12.55 MJ/kg）,直到分娩,所有母猪哺乳期均饲喂同一饲粮。分娩后,分别从CON和LE组中挑选体重为平均体重±0.05 kg的后代公猪各15头,断奶后所有公猪按阶段饲喂相同饲粮,于仔猪120日龄时结束试验。记录公猪每个月的体重并计算阶段平均日增重和平均日采食量;采集28和120 d的血液进行血清生化指标和免疫相关细胞因子检测,采集28和120 d的睾丸进行睾丸细胞计数和睾丸免疫相关基因检测。结果表明,与对照组相比,LE组0~59 d平均日增重极显著降低（P<0.01）,28~89 d平均日采食量和0 d睾丸重显著降低（P<0.05）,28 d睾丸指数显著增加（P<0.05）;LE组0和120 d睾丸组织内间质细胞数目、120 d生殖细胞数目、28和120 d支持细胞数目均显著降低（P<0.05）;LE组血清中28 d甘油三酯（TG）和120 d睾酮（T）含量均极显著升高（P<0.01）、雌二醇（E₂）含量极显著降低（P<0.01）,TG、T和E₂含量均存在时间和能量的交互作用（P<0.01）;LE组血液中胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）的含量120 d时极显著降低（P<0.01）,低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、TC、HDL-C三者均无时间和能量的交互作用（P>0.05）。随着公猪日龄增加,血液中白细胞介素-1α（IL-1α）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、免疫球蛋白（IgG）浓度均极显著增加（P<0.01）,其中TNF-α和IL-1β有能量和时间的交互作用。与对照组相比,LE组28 d时TNF-α含量显著降低（P<0.05）,120 d时IL-1β水平显著升高（P<0.05）。LE组28 d紧密连接蛋白1（ZO1）及0和28 d闭合蛋白（Occludin）基因相对表达量均显著降低（P<0.05）,28和120 d时连接黏附分子1（JAM1）基因相对表达量显著增加（P<0.05）。LE组0 d时CCL4基因和28 d时IL-1α基因相对表达量均显著降低（P<0.05）,0和120 d时趋化因子2（CCL2）基因及28 d时细胞间黏附分子1（ICAM1）和酪氨酸激酶2（JAK2）基因相对表达量均显著增加（P<0.05）。与对照组相比,28 d时Toll样受体1（TLR1）基因、0 d时肿瘤坏死因子受体超家族成员Ⅰ型（TNFRSF1A）基因相对表达量均显著降低（P<0.05）,0 d时B细胞κ轻肽基因增强子核因子抑制因子（NFKBIA）、IL-1β和干扰素（IFNG）基因相对表达量均显著增加（P<0.05）。综上所述,母猪妊娠期摄入12.55 MJ/kg能量水平饲粮可降低后代公猪日增重、平均日采食量和睾丸重;降低后代公猪睾丸内生殖细胞数量及免疫相关细胞因子和睾丸免疫相关基因的表达,从而对后代成年后的免疫能力和繁殖性能产生深远影响。     

牦牛性激素结合蛋白基因克隆及组织表达研究

试验旨在阐明牦牛性激素结合蛋白（SHBG）基因CDS序列及其在母牦牛生殖轴中的表达特点,为探讨该基因在牦牛繁殖中的调控作用奠定基础。试验分别采集5头健康成年母牦牛和母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫组织,根据NCBI公布的黄牛SHBG基因设计特异性扩增引物,分别采用RT-PCR技术、生物信息学方法和实时荧光定量PCR技术进行牦牛SHBG基因克隆、序列分析和组织表达检测。结果显示,牦牛SHBG核苷酸序列的编码区（CDS）全长为1 206 bp,共编码401个氨基酸,其中,亮氨酸（L）、甘氨酸（G）、脯氨酸（P）和丝氨酸（S）较多,含量分别为16.5%、9.7%、8.7%和9.0%。蛋白质分子式为C₁₉₄₄H₃₀₆₁N₅₃₅O₅₆₆S₁₀,分子质量为43.30 ku,理论等电点5.63,与黄牛核苷酸和氨基酸同源性分别为99.0%和97.5%。SHBG蛋白为亲水不稳定蛋白,存在跨膜结构和信号肽;二级结构中主要包含无规则卷曲和延伸链,与三级结构分析一致。系统进化树表明牦牛与黄牛亲缘关系最近。SHBG基因在牦牛输卵管的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,其他组织之间差异不显著（P>0.05）。SHBG基因在黄牛输卵管表达量极显著高于牦牛（P<0.01）,在黄牛卵巢表达量显著高于牦牛（P<0.05）,两物种的其他组织中表达量差异不显著（P>0.05）。本研究探讨了牦牛SHBG基因序列及其在生殖轴的表达特性,为进一步研究SHBG基因对牦牛繁殖调控作用提供了一定理论依据。     

SIRT1对牦牛卵母细胞体外成熟与老化的影响

旨在探索SIRT1在牦牛卵母细胞体外成熟与老化过程中的作用。本研究在体外成熟液中分别添加SIRT1特异性激动剂SRT2104（SRT组）和特异性抑制剂Inauhzin（INZ组），牦牛卵丘卵母细胞复合体（COCs）体外培养24 h后，观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况；利用免疫荧光检测体外培养24与36 h后卵母细胞内的ROS水平；采用实时荧光定量PCR法检测体外培养24与36 h后卵母细胞内SIRT1、FOXO3a、SOD2以及Bax的表达水平；体外培养24与36 h后的牦牛卵母细胞进行体外受精，观察并统计其卵裂率与囊胚形成率。结果显示，体外培养24 h，SRT组的卵丘细胞扩展程度显著高于对照组（P<0.05），而INZ组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率显著低于对照组（P<0.05）。随着体外培养时间的增加，卵母细胞内的ROS水平显著增加（P<0.05）；添加SRT2104能显著抑制卵母细胞中ROS水平的积累（P<0.05），而添加Inauhzin则显著上调卵母细胞内的ROS水平（P<0.05）。体外培养24 h后，SRT组SIRT1、FOXO3a与SOD2的表达水平显著高于对照组（P < 0.05），但Bax的表达水平显著降低（P<0.05）；INZ组的SIRT1、FOXO3a与SOD2表达均显著低于对照组（P<0.05），但Bax的表达水平显著上调（P<0.05）。牦牛卵母细胞体外培养24 h后，SRT组的卵裂率与囊胚形成率显著高于INZ组和对照组（P<0.05）；卵母细胞体外培养36 h后，INZ组的卵裂率和囊胚形成率显著低于其他组（P<0.05）。综上表明，SIRT1参与了牦牛卵母细胞的体外成熟，在体外培养液中适当添加SIRT1激动剂，有利于卵母细胞体外成熟及缓解老化，同时改善早期胚胎的发育能力。     

低氧诱导因子-1α对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化的影响

本研究旨在探讨低氧诱导因子-1α（HIF-1α）对牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化（EMT）的影响。首先对牦牛肾小管上皮细胞进行培养鉴定,并选取第三代细胞对其分别进行药物处理（DMOG组）和不做药物处理（对照组）,检测EMT相关基因在mRNA和蛋白水平的表达变化,并观察细胞形态变化。结果表明：使用Ⅰ+Ⅱ型胶原酶可以更好地获得肾小管上皮细胞;免疫荧光结果细胞CK18表达呈阳性,Vimentin和CD31呈阴性表达;qRT-PCR和Western blot结果表明,DMOG组中的HIF-1α,TGF-β1,α-SMA在mRNA和蛋白水平均较对照组有极显著增加（P<0.01）,而E-cadherin的表达显著降低（P<0.05）;经药物干预后,细胞形态由铺路石样转变为长梭形,经鉴定长梭形细胞为间质细胞。本研究成功建立了牦牛肾小管上皮细胞的分离培养体系,并发现HIF-1α表达上调可以促进牦牛肾小管上皮细胞上皮-间质转化。     

幼年牦牛不同部位皮肤毛囊的组织学结构及TGF-β2与HIF-1α差异性表达分析

旨在探究幼年牦牛皮肤毛囊的组织学结构和TGF-β2及HIF-1α对幼年牦牛皮肤毛囊生长发育的影响，选取10头健康幼年牦牛，采集其颈部、背部、胸部、腹部、小腿部、腋下及阴囊皮肤组织，制作石蜡切片后，采用HE和Sacpic染色，对各部位皮肤组织中毛囊进行观察和计数，并筛选出多毛及少毛部位。利用qRT-PCR、Western blot及免疫组织化学法对TGF-β2和HIF-1α在幼年牦牛多毛皮肤和少毛皮肤进行定位与定量的初步研究。结果表明，幼年牦牛皮肤的毛囊分布于真皮层，常与汗腺及皮脂腺伴行，毛髓质及内根鞘结构不完整。Sacpic染色可见毛囊内根鞘为红色，外根鞘为苍绿色，结缔组织鞘为蓝绿色。腹部皮肤的毛囊数量最多[（2 085±15）个·cm^-2]，阴囊数量最少[（158±15）个·cm^-2]。免疫组织化学结果显示，TGF-β2及HIF-1α主要表达在表皮层、毛囊外根鞘、皮脂腺及汗腺。TGF-β2在阴囊和腋下的mRNA转录水平和蛋白质表达水平均显著高于腹部和背部。HIF-1α在腹部的mRNA转录水平和蛋白质表达水平均显著高于其他三个部位。幼年牦牛的毛囊处于退行期，在腹部数量最多，背部次之，阴囊最少；TGF-β2和HIF-1α在不同部位皮肤中的表达水平存在显著差异，为进一步研究TGF-β2和HIF-1α对牦牛皮肤毛囊生长发育的影响提供理论依据。     

原花青素对玉米赤霉烯酮诱导牦牛颗粒细胞氧化损伤的保护作用研究

旨在探究原花青素（procyanidins,PC）在玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）诱导牦牛颗粒细胞产生氧化损伤后,对颗粒细胞生长增殖、抗氧化性以及激素分泌的影响。本试验选取3～5岁的健康牦牛（n=3）,完成卵巢颗粒细胞的分离培养,并通过免疫荧光染色鉴定颗粒细胞纯度。通过CCK-8法分别比较不同浓度ZEA （0（对照组）、5、10、20、40、60、80和100 μmol·mL^-1）、不同浓度PC （0（对照组）、0.05、0.5、2.5、5、10、50和100 μg·mL^-1）以及50 μmol·mL^-1 ZEA+5 μg·mL^-1 PC联合处理对牦牛颗粒细胞活性的影响。通过ELISA法检测对照组（未添加ZEA及PC）、50 μmol·mL^-1 ZEA组和50 μmol·mL^-1ZEA+5 μg·mL^-1PC联合处理组牦牛颗粒细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）以及雌二醇（E₂）水平。采用实时荧光定量PCR法检测不同组颗粒细胞中部分增殖生长、凋亡、抗氧化及E₂合成相关基因的表达水平。结果显示,本研究所分离培养得到的细胞表达颗粒细胞标志蛋白FSHR,具有较高的纯度,可以满足后续试验要求。添加不同浓度ZEA后,颗粒细胞活力随着ZEA浓度的升高而显著降低（P<0.05）。在一定浓度范围内（0~5 μg·mL^-1）,随着浓度的上升,PC对颗粒细胞的活力有显著提高作用（P<0.05）,且在浓度为5 μg·mL^-1时对细胞活力的提高作用最明显。与ZEA处理组相比,ZEA与PC联合处理后颗粒细胞的数量增加且细胞活力极显著提高（P<0.05）,颗粒细胞增殖生长相关基因PCNA和IGF-Ⅱ 以及抗凋亡相关基因XIAP和BCL-2的表达显著上调（P<0.05）。相反,促凋亡相关基因BAX和CASP3的表达显著下调（P<0.05）。同时,ZEA+PC联合处理后能显著降低牦牛颗粒细胞活性氧水平并促进颗粒细胞分泌E₂（P<0.05）,颗粒细胞中的抗氧化相关基因SOD2、GPX1及CAT和E₂合成相关基因STAR、CYP11A1及HSD3B的表达量显著上调（P<0.05）。上述结果表明,PC可提高经ZEA处理后颗粒细胞的生长增殖能力,上调颗粒细胞的活力,提高抗氧化能力,降低ROS水平以及提高E₂的分泌水平。综上所述,PC对ZEA诱导的牦牛颗粒细胞氧化损伤有一定保护作用。本研究为ZEA毒性的防治和畜牧业生产中PC的应用提供了一定的研究数据和理论支持。     

KDM1A对牦牛卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能的影响

旨在探讨KDM1A对牦牛卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能的影响。本研究在体外成熟液中添加不同浓度的KDM1A特异性抑制剂GSK-KDM1A,牦牛卵丘-卵母细胞复合体（COCs）体外培养24 h后,观察卵丘细胞的扩展和第一极体的排出情况;利用免疫荧光检测体外培养过程中卵母细胞内KDM1A的表达模式;采用实时荧光定量PCR检测体外培养卵母细胞内Kdm1a、Oct-4、Sox-2以及Nanog的表达水平;体外培养成熟后的牦牛卵母细胞进行体外受精,观察其卵裂率与囊胚形成率。结果显示,体外培养24 h后,GSK-KDM1A组的卵丘细胞扩展程度显著低于对照组（P<0.05）,而320 nmol·L^-1组的卵丘细胞扩展程度和第一极体排出率均显著低于160 nmol·L^-1组（P<0.05）。在卵母细胞体外成熟过程中,Kdm1a呈现动态表达模式,MⅠ期的表达水平显著低于GV和MⅡ期（P<0.05）;添加GSK-KDM1A能显著抑制卵母细胞中KDM1A蛋白的表达（P<0.05）,320 nmol·L^-1组各时间点KDM1A的表达量均显著低于160 nmol·L^-1组（P<0.05）。GSK-KDM1A组卵母细胞内Oct-4与Sox-2的表达水平显著高于对照组（P<0.05）,但Nanog的表达水平无显著差异（P>0.05）。牦牛卵母细胞体外成熟后,GSK-KDM1A组的卵裂率显著低于对照组（P<0.05）,但囊胚形成率无显著变化（P>0.05）。综上表明,KDM1A参与调控牦牛卵母细胞减数分裂成熟过程,GSK-KDM1A能有效抑制KDM1A的表达,影响卵母细胞减数分裂成熟及其发育潜能,揭示KDM1A在此过程中扮演重要角色。     

饲喂PRL抑制剂对燕山绒山羊毛囊发育的影响

旨在研究绒山羊毛囊生长期饲喂催乳素（PRL）抑制剂对毛囊发育的影响。本研究选择3月龄体重相近（（23.01±4.82） kg）、健康良好的燕山绒山羊公羊20只,随机分为两组,每组10只,分别为对照组和试验组,试验组饲喂PRL抑制剂（0.06 mg·kg^-1）,试验期90 d。试验结束时采集羊绒纤维、血液和皮肤样品,分析饲喂PRL抑制剂对山羊绒长度、细度、血液指标、毛囊性状及皮肤组织PRL、MTNR1a和RORα mRNA表达水平的影响。结果表明,饲喂PRL抑制剂显著提高了绒山羊初级毛囊数量、次级毛囊数量和S/P值（P<0.05）,并显著提高了活性初级毛囊占比和活性次级毛囊占比（P<0.05）,对山羊绒伸直长度和细度无显著影响（P>0.05）。饲喂PRL抑制剂3个月对绒山羊血清中PRL、MT、IGF-1、COR、GH、T₄和T₃均无显著影响（P>0.05）,但显著降低了皮肤中PRL和MTNR1a mRNA表达水平（P<0.05）,对RORα mRNA表达量无显著影响（P>0.05）。综上,在绒山羊毛囊生长期抑制PRL分泌可能是通过降低皮肤中PRL和MTNR1a基因的表达来促进毛囊发育。     

N-乙酰半胱氨酸对山羊子宫内膜基质细胞增殖及相关基因表达的影响

旨在探究N-乙酰半胱氨酸（N-acetyl-L-cysteine,NAC）对山羊子宫内膜基质细胞（goat endometrial stromal cells,gESCs）的影响。本研究以山羊子宫内膜基质细胞为对象,体外培养基中添加浓度梯度分别为100、200、400 μmol·L^-1的NAC,将0 μmol·L^-1 NAC视为空白组,运用CCK-8法筛选NAC的最适浓度并判断其对细胞的增殖情况,随后通过DCFH-DA探针、RT-qPCR分别检测最适浓度NAC对细胞内活性氧含量、细胞周期、增殖相关因子及山羊繁殖性能相关基因TGF-β1、TGF-β3 mRNA表达水平的影响。结果表明：200 μmol·L^-1 NAC浓度较其它梯度对山羊子宫内膜基质细胞增殖的影响更为显著,此外,200 μmol·L^-1 NAC较空白组降低了细胞ROS的含量（P<0.01）,从而延缓细胞的衰老。RT-qPCR结果显示：200 μmol·L^-1 NAC添加能极显著提高细胞周期及增殖相关因子CyclinA1、CyclinE、PCNA mRNA的表达水平（P<0.01）,降低细胞周期因子CyclinD2的mRNA表达量（P<0.01）;并极显著降低转化生长因子家族TGF-β1基因（P<0.01）、显著降低TGF-β3基因（P<0.05）的mRNA表达水平。故本研究推测200 μmol·L^-1 NAC可能通过调控细胞中CyclinA1、CyclinE、PCNA、CyclinD2的表达水平来促进细胞的增殖并通过调控转化生长家族因子TGF-β1、TGF-β3的表达水平影响山羊的繁殖性状,为进一步研究NAC对山羊繁殖性状的影响机理提供理论基础。     

干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞乳脂和酪蛋白的影响

通过将小干扰-17β-羟基固醇脱氢酶Ⅳ（si-HSD17B4）基因转染水牛乳腺上皮细胞,检测酪蛋白、甘油三酯含量及脂肪酸相关基因的表达变化,从而揭示干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中乳脂和酪蛋白的影响。采用实时荧光定量PCR检测HSD17B4 mRNA在水牛各个组织中的相对表达量。合成3条水牛HSD17B4小干扰RNA （siRNA）和1条对照si-HSD17B4-nc （si-nc）,并筛选干扰效果最佳的片段和时间。si-HSD17B4转染水牛乳腺上皮细胞后,通过酪蛋白试剂盒检测酪蛋白的表达情况,通过甘油三酯测定和油红O染色检测甘油三酯含量,通过实时荧光定量PCR检测干扰HSD17B4基因对甘油三酯、脂肪酸合成以及氧化相关基因表达的影响。结果表明,HSD17B4基因在水牛心脏和卵巢中相对高表达,且显著高于其他组织（P<0.05）。3条HSD17B4 siRNA片段均能有效地抑制HSD17B4基因的表达,其中si-HSD17B4-1干扰效果最佳,HSD17B4 mRNA表达量极显著低于对照组（P<0.01）;最佳干扰时间为24 h。酪蛋白检测结果显示,干扰HSD17B4基因对水牛乳腺上皮细胞中酪蛋白合成无影响。甘油三酯测定结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中甘油三酯含量上升,差异显著（P<0.05）。油红O染色结果显示,干扰HSD17B4基因后细胞中的脂滴明显增多。实时荧光定量PCR检测结果显示,干扰HSD17B4基因会使FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2、PLIN2、BTN1A1基因表达量上调,分别上调9.28（P<0.01）、1.36（P<0.05）、1.17（P<0.05）、1.83（P<0.01）、1.60（P<0.01）和2.17（P<0.01）倍;同时使PPARA、SREBP1C、SCD、ACSS2、ACACA、AGPAT6、LPIN1、XDH、ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因表达量下降,分别下调至50.55%（P>0.05）、61.15%（P<0.01）、84.91%（P<0.01）、89.34%（P<0.01）、21.88%（P<0.01）、86.48%（P<0.01）、25.35%（P<0.01）、27.24%（P<0.01）、41.74%（P<0.01）、22.17%（P<0.01）、62.70%（P<0.01）和70.33%（P<0.01）。结果表明,HSD17B4基因在水牛组织中广泛表达;si-HSD17B4高效抑制HSD17B4基因在水牛乳腺上皮细胞中的表达,未检测到干扰HSD17B4基因对乳腺上皮细胞酪蛋白的影响,干扰HSD17B4基因上调了FABP3、ACSL1、DGAT1、DGAT2基因的表达,从而促进甘油三酯的合成,同时降低ABCD1、ACOX2、EHHADH、SCP2基因的表达,减少脂肪酸β-氧化。