鹅副粘病毒F和HN基因的克隆及原核表达载体的构建

根据发表的鹅副粘病毒SF02株全基因组序列,分别设计合成一对引物和二对引物,分别采用RT-PCR方法和RT-套式PCR扩增出与预期设计大小相符的F基因和HN基因特异性条带.将扩增出的DNA片段克隆到pMD18-T载体中,转化TGI感受态细胞,经AMP/IPTG/X-Gal平板筛选,酶切鉴定,获得阳性重组质粒.对重组质粒进行序列测定,结果表明:鹅副粘病毒JS/1/97/Go株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸残基;F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV的强毒株特征相符.HN基因全长1716bp,编码571个氨基酸残基.将F基因插入到原核表达质粒pGEX-6P-1的EcoR Ⅰ、Xho I多克隆位点之间,转化到TGI感受态细胞中,获得了表达F基因的阳性亚克隆重组质粒;将HN堪因插入原核表达质粒pProEX HTb的XBaⅠ、XhoⅠ多克隆位点之间,转化到TGI感受态细胞中,获得了表达HN基因的阳性亚克隆重组质粒.     

鹅副粘病毒F基因的克隆及遗传变异分析

以鹅副粘病毒LN-7-02株基因组RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出F基因片段,并克隆至T载体.经质粒PCR及酶切鉴定后,对阳性克隆进行测序.测序后拼接得到F基因上游539bp核苷酸序列,并推导出ATG后1～374bp氨基酸序列.序列分析表明,LN-7-02株F蛋白裂解位点区的氨基酸组成为112R-R-Q-K-R-F117,与禽Ⅰ型副粘病毒(APMV-1)强毒株特征相符.将LN-7-02与AMPV-1株CH2000、F48E9和LaSota进行同源性比较,结果LN-7-02与CH2000、F48E9和LaSota的同源性分别为91.8%、86%和84%,表明该毒株相对于经典的AP-MV-1在F基因上已发生了较大变异.根据国内外70株APMV-1的F基因核苷酸序列绘制系统发育进化树,结果疫苗株Lasota属于基因Ⅱ型,经典株F48E9属于我国特有的基因Ⅸ型,而LN-7-02株与鹅副粘病毒JS-9-01、ZJ-100和GD-QY97同属于APMV-1基因Ⅶ型.     

一株鹅Ⅰ型副粘病毒全基因克隆与序列分析

本研究分离了一株鹅I型副粘病毒（ZQ042）,应用RT-PCR技术对其编码的核蛋白（NP）、磷蛋白（P）、基质蛋白（M）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（HN）、融合蛋白（F）和巨蛋白（L）6种主要结构蛋白分别进行扩增,然后将其克隆到pMD18-T载体后进行序列测定和拼接;并将克隆到的6个基因片段与国内外已报道的I型副粘病毒基因序列进行比较分析。分析结果表明,鹅副粘病毒分离株ZQ042 F基因与La Sota株同源性最高,同源率为99.1%,与其它各毒株各基因同源性均较低。     

鹅副粘病毒HZ株F蛋白基因的克隆及序列分析

以鹅副粘病毒HZ株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出F基因片段,然后将其克隆到pUCm-T载体中。经转化、筛选、酶切和PCR鉴定后,初步获得含鹅副粘病毒F基因的阳性克隆,并进行序列测定验证。结果表明,该基因由1 662个核苷酸组成,共编码553个氨基酸。与GenBank下载的9株参考毒株的F基因作同源性比较,发现HZ株与ZJ1、F48E9、Lasota等毒株的核苷酸同源性分别为98.3%、85.4%、82.7%;氨基酸同源性分别为97.8%、90.6%、88.1%。说明HZ株与经典的鸡新城疫病毒(NDV)在F基因上存在很大的差异,而与近年来的分离株亲缘关系较近。     

鹅副粘病毒NA-1分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析

鹅副粘病毒分离株NA-1经11日龄鸡胚增殖后纯化.提取病毒的基因组RNA,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1.7kb大小相符合的特异条带.将扩增产物提纯后克隆入pMD 18-T载体,经纯化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1 740bp,该基因的ORF总长为1 716 bp,编码571个氨基酸.与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列,发现所测NA-1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为97.3%,与F48E9同源性为84.5%,与La Sota为82.2%.同源性分析表明NA-1相对于NDV在HN基因上发生了较大的变异.     

猪源副粘病毒的分子鉴定

参照GenBank发表的相关猪源副粘病毒和禽源副粘病毒融合蛋白F基因核苷酸序列,设计并合成了4对引物,采用RT-PCR技术对本研究室分离的猪源副粘病毒JL-1株F基因进行探索性扩增、序列测定,在此基础上设计引物扩增HN基因、进行序列测定,分析F、HN基因序列,对该病毒进行分子鉴定。结果显示,扩增出了JL-1株F、HN基因目的条带,序列分析表明其与猪源副粘病毒病家族其他成员即蓝眼病病毒、尼帕病毒、梅那哥病毒同源性很低,与禽副粘病毒1型（APMV-1）具有高度同源性。初步确定分离的猪源副粘病毒为禽副粘病毒1型。     

如何预防和扑灭鹅副粘病毒病

(一)正确使用疫苗目前鹅副粘病毒病没有活苗可供使用,仅有灭活苗.鹅副粘病毒属于禽副粘病毒Ⅰ型F基因Ⅶ型毒株,它不同于新城疫常用的弱毒苗和中等毒力疫苗的毒株,因基因型不同,而用上述新城疫疫苗株制备的灭活苗进行免疫不能防制该病的发生.应选用经过基因型鉴定的毒株制备灭活苗,才能确保有效的免疫效果.     

鹅副粘病毒与鹅细小病毒主要免疫原性基因在Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的共表达及其免疫

根据测得的鹅源副粘病毒（GPMV）NA-1株F基因序列,设计1对特异性引物,用作者构建的含F基因的质粒pGF为模板,PCR扩增F基因片段（去除终止密码子）,与转座载体pFastBac连接,构建重组质粒pFastBac-F,并进行测序鉴定;根据测得的鹅细小病毒（GPV）GD-01株VP3基因序列,设计1对特异性引物,用作者构建的重组质粒pGVP3为模板,PCR扩增出有Linker的VP3基因（命名为LVP3）。再将重组质粒pFastBac-F与LVP3片段连接,构建重组转座载体pFF-LVP3,转化到DH10Bac宿主菌,将目的基因定向插入到Bacmid质粒中,经筛选获得重组Bacmid F-L-VP3转染Sf9昆虫细胞,所表达产物经SDS-PAGE和Western-blot检测,特异蛋白分子质量约123 000。将表达蛋白免疫雏鹅,经抗体测定证明,表达的F-VP3重组蛋白能诱导机体产生特异性免疫应答。     

一株雏鹅呼肠孤病毒的分离与鉴定

2013年福建省某鹅场发生一起以肝脏和脾脏均有灰白坏死点(肝白点)为典型病变特征的急性传染病。本研究利用10日龄非免疫番鸭胚,从病死雏鹅肝脏中分离到1株病毒。病毒分离株没有血凝活性,其ELD50为10-3.25/0.2 m L,可被鹅呼肠孤病毒高免血清特异性中和。利用鹅呼肠孤病毒特异性检测引物对FJ-06株病毒尿囊液进行RT-PCR检测,可扩增到约572 bp特异性目的条带。将RT-PCR产物进行克隆测序,Blast分析表明,克隆的基因片段为鹅呼肠孤病毒δC蛋白基因片段。结果表明成功分离到1株鹅呼肠孤病毒。     

鹅副黏病毒核酸探针检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的鹅副黏病毒F基因序列,设计合成1对引物,利用RT-PCR扩增出1条与目的片段大小一致,约856bp的基因片段,回收并纯化此PCR产物。用随机引物法合成cDNA,地高辛标记,建立了地高辛标记探针检测鹅副黏病毒的方法。该探针能与鹅副黏病毒核酸发生特异性杂交,最低检出限量为3ng/L;而与H9N2亚型禽流感病毒、鹅细小病毒、大肠杆菌等核酸杂交均为阴性。对疑似鹅副黏病毒感染病变组织检测结果表明,气管、肺脏、脾脏、肝脏均可检测出鹅副黏病毒,以气管的检出率为最高。该研究为鹅副黏病毒的诊断和流行病学调查提供了一种可靠的方法。     

禽分枝杆菌副结核亚种hsp65与鹅副黏病毒HN融合基因真核表达载体的构建与表达

为探索禽分枝杆菌副结核亚种（MAP）的热休克蛋白65（hsp65）对鹅副黏病毒（GPMV）血凝素神经氨酸酶（HN）的分子佐剂作用及构建GPMVDNA疫苗,针对GPMV的HN基因和MAP的hsp65基因设计引物,PCR克隆扩增两个基因,分别将二者先后与真核表达载体pVAXl连接,构建了pVAXl-HN、pVAXl-hsp65-HN,并通过PCR、酶切和序列鉴定所获重组质粒;应用脂质体法将其转染至Marc-145细胞,RT-PCR和间接免疫荧光试验证实hsp65和HN在Marc-145细胞中获得了表达。本研究为制备新型GPMVDNA疫苗及探索hsp65在DNA疫苗中的应用奠定了基础。     

鹅副黏病毒与新城疫病毒对鸡胚和鹅胚成纤维细胞的感染性分析

用鸡新城疫病毒F48E9,Komarov, LaSota,V4/66株和鹅副黏病毒SF02株分 别感染鸡胚和鹅胚成纤维细胞,用MTT显 色方法检测存活细胞数目。结果表明,不同 毒力新城疫病毒致细胞病变的作用不一样, 鸡新城疫强毒F48E9株和鹅副黏病毒SF02 株均引起两种细胞几乎全部死亡,感染动物 时,SF02与NDV强毒株的致病性有显著的 区别,但感染细胞时,二者并无明显差别; NDV与GPMV在感染水禽时的致病性差异 并不是因为诸如细胞膜受体等细胞水平的因 素不同造成的,可能与干扰素途径有关。     

鹅副粘病毒NP基因的原核表达及表达产物抗原性检测

根据GenBank中发表的GPMVSF02株的NP基因的核苷酸序列设计合成一对引物，通过RT-PCR扩增JS／1／97／Go株的NP基因，将其克隆人pMDl8-T载体，序列测定和分析表明：所扩增的NP基因的核苷酸长为1470bp，共编码490个氨基酸。再将NP基因定向亚克隆至原核表达载体pGEX-6P的多克隆位点，经酶切鉴定后将含有NP基因的阳性亚克隆重组质粒转化到大肠杆菌BL21中，用诱导荆IPTG分别以不同的浓度进行诱导，并在不同的诱导时间进行采样，样品经处理后通过SDS-PAGE、Westernblot和Dot-ELISA进行分析。结果显示：以终浓度为1mmol／LIPTG进行诱导4h表达可达到高峰。表达的融合蛋白大小约为80kD，并具有良好的抗原性。     

GPMV NA-1株致弱F基因真核质粒的构建及免疫试验

将本实验室致弱的GPMV F基因克隆到真核表达载体pCI-neo中,构建pCI-rf质粒,经脂质体法转染BHK细胞后,Western blotting检测pCI-rf能正常表达。采用pCI-rf和本实验室构建的含有GPMV的F基因的真核表达质粒pCI-f分别肌注7~9日龄雏鸡,间接ELISA检测抗体,并采用淋巴细胞增殖试验和特异性CTL杀伤活性试验对试验鸡的细胞免疫进行检测,最后做攻毒保护试验。结果表明,pCI-f和pCI-rf能诱导试验鸡产生细胞免疫和体液免疫应答,与LaSota疫苗比较,免疫效果没有显著差异。PCR扩增检测结果显示,未能从免疫雏鸡各组织的基因组中扩增出F基因片段。     

不同禽源的禽Ⅰ型副黏病毒株毒力、免疫原性及抗原相关性研究

从病死的鸡、鹅、鸽中分离到3株禽I型副黏病毒(CPMV、GPMV、PPMV)。毒力测定结果显示,CPMV、GPMV的毒力与鸡新城疫病毒(NDV)F48E9株的毒力相似,为强毒型;PPMV的毒力与鸡NDVLaSota株的毒力相似,为自然弱毒株。对该分离株F基因裂解位点的序列分析结果表明,CPMV、GPMVF裂解位点氨基酸序列为112K-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的序列特征;PPMV F裂解位点氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,属于弱毒株的特征性序列。将该3株病毒制成灭活疫苗,分别免疫鸡,结果都能诱导鸡体产生较高水平的HI抗体;再分别以CPMV、GPMV攻击免疫鸡群,结果显示免疫鸡群可得到保护,而非免疫鸡群被攻击后全部致死。用HI方法检测3株病毒与Lasota株之间的交叉血凝抑制试验,结果表明LaSota与GPMV两毒株间的抗原性无明显差异,LaSota与CPMV、PPMV两毒株间的抗原性有较小的差异。本研究将有助于进一步开展禽Ⅰ型副黏病毒的致病机制和新型疫苗等方面的研究。     

猪瘟病毒一步法RT PCR检测方法的建立

本研究根据NCBI公布的猪瘟病毒石门毒株的E2基因序列，设计、合成了1对检测猪瘟病毒E2基因的RT-PCR引物。自疑似猪瘟病料及接猪瘟F114毒的PK-15细胞中提取总RNA，经一步法RT-PCR扩增E2基因。建立了猪瘟病毒E2基因RT-PCR检测方法，RT-PCR从26份疑似猪瘟病料中检出阳性病料24份，阳性检出率为92.3%；结果表明，建立的 RT-PCR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于CSFV的分离鉴定、临床病料的检测和分子流行病学调查。     

荧光定量RT-PCR检测犬瘟热方法的建立和应用

根据Gen Bank发表的犬瘟热病毒(CDV)的F基因序列,经过分析在F片段的保守区域内设计引物,建立了SYBR Green I荧光RT-PCR检测CDV的方法,并通过对厦门市宠物医院收集的临床发病和疑似发病的犬病料(包括眼分泌物、鼻拭子、唾液、血液、尿液等)的检测,结果表明:本研究建立的快速检测CDV的SYBRGreen I荧光RT-PCR方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,值得推广应用。     

鹅源副黏病毒HN基因真核表达质粒的构建及基因疫苗的研究

本试验通过FCR技术从pGEM-HN质粒中扩增出了HR基因，构建了真核表达质粒pcDNA3-HN。真核表达质粒pcDNA3-HN肌肉注射免疫鸡后，HI血清抗体效价较空白对照组高，攻毒后鸡发病、死亡均少于空白对照组，有27%-36％的鸡耐过。但血清抗体效价较灭活苗组低，发病率和死亡率较灭活苗组高。试验结果表明HN基因在鸡体内，得到了表达，并使鸡获得了一定的免疫力，但保护作用不及鹅副黏病毒油乳剂灭活苗。