感染日本血吸虫前后东方田鼠血清补体的动态变化和杀虫作用

东方田鼠是迄今为止发现的唯一一种具有天然抗日本血吸虫病特性的哺乳动物,但具体抗病机制尚不明确。本研究应用组织培养法比较了东方田鼠和BALB/c鼠感染日本血吸虫尾蚴后1、3、8、12、15 d的皮肤、肺脏和肝脏中童虫回收情况,结果表明东方田鼠对日本血吸虫的杀伤主要发生在感染后1～3 d和8～12 d。应用RT-PCR和ELISA检测东方田鼠和BALB/c鼠的补体相关分子C3、C9、CD59和DAF的转录水平,结果显示BALB/c小鼠各指标变化不明显,东方田鼠感染后8 d各因子转录水平显著升高。体外杀虫试验结果显示,东方田鼠正常血清和灭活补体血清孵育的日本血吸虫童虫死亡率分别为85.50%±7.15%和60.99%±8.61%,差异具有显著统计学意义(P 0.001)。结果表明东方田鼠补体对日本血吸虫童虫具有显著杀伤效果,东方田鼠早期对日本血吸虫的杀伤作用可能和补体相关。     

东方田鼠抗日本血吸虫抗体水平检测与分析

东方田鼠具有抗日本血吸虫病的特性，观察东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴后的特异性抗体水平变化，可为阐明其抗病机制提供依据。本试验用间接ELISA方法检测东方田鼠抗成虫可溶性抗原（SWAP）和几种日本血吸虫基因重组抗原（Sj28-GST、LHD-SjTP1、C-SjParamyosion）的特异性抗体水平动态变化，并检测东方田鼠感染日本血吸虫尾蚴前、后的IgG3亚类特异性抗体水平。结果东方田鼠在攻击日本血吸虫尾蚴后，抗SWAP的特异性抗体水平有所升高，而抗几体基因重组抗原的特异性抗体水平低，没有显著变化。东方田鼠正常血清中抗SWAP和IgG3亚类抗体的OD值是牛血清白蛋白（BSA）对照的31倍。结果表明，在东方田鼠血清中有较高水平的SWAP的IgG3亚类抗体，值得进一步深入探讨。     

东方田鼠和小鼠感染日本血吸虫后组织与血清蛋白组分差异比较研究

探讨东方田鼠和小鼠感染日本血吸虫前后不同时点组织与血清中蛋白质电泳谱的变化。分别提取东方田鼠感染日本血吸虫(0、7、12、25 d) 和小鼠感染日本血吸虫(0、7、12、45 d)后的肝脏、脾脏、肺脏蛋白及血清进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,对结果比较分析并进行组织病理形态学观察。结果显示,小鼠感染日本血吸虫第7和12天后肝脏150 ku附近蛋白质条带较东方田鼠表达量明显增高;东方田鼠在感染日本血吸虫后40~50 ku附近蛋白质条带较正常东方田鼠表达明显上调;感染第7天后肺脏40 ku附近蛋白质条带较其他时间点变化明显;小鼠感染日本血吸虫第7、12和45天后血清中IgG类蛋白质表达量较东方田鼠显著增高。东方田鼠和小鼠在日本血吸虫感染后不同时点间的组织及血清蛋白组分存在差异,东方田鼠肝脏和血清中150 ku附近蛋白条带较其他动物特异,蛋白质表达丰度高,该蛋白可能与东方田鼠抗日本血吸虫相关。     

东方田鼠组织与血清中抗日本血吸虫相关蛋白的分离与筛选

本试验以兔、牛、人及感染日本血吸虫后小鼠血清蛋白为对照,分别提取东方田鼠和小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、皮肤、骨髓和脑组织蛋白,进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,综合比较和筛选东方田鼠组织及血清中潜在的抗日本血吸虫相关蛋白组分。结果表明,随着感染日龄的增加,小鼠在感染日本血吸虫后12和45 d,其血清中85 ku附近蛋白质条带较东方田鼠表达量明显上调,且有继续升高的趋势;东方田鼠肝脏及血清中150 ku组分蛋白电泳条带与其他动物相同组织中相应蛋白质在表达量存在显著差异,蛋白质表达丰度高,该蛋白质组分可能与东方田鼠抗日本血吸虫作用相关。     

东方田鼠重复感染日本血吸虫试验研究初步

本试验以1000条日本血吸虫尾蚴同时攻击感染东方田鼠洞庭湖种群和东方田鼠宁夏指名亚种进行重复感染对比试验，并在攻击后不同天数分别同时解剖相数目的两种群东方田鼠，收集其体内不同时段，不同部位的日本血吸虫童虫，比较结果证实东方田鼠对日本血吸虫具有天然的抗性，其抗性是可遗传的，不以东方田鼠的地域分布不同、生活环境的差异或传代数目的变化而有所不同，与获得必免疫无关。     

东方田鼠抗日本血吸虫病现象的观察

本试验分别应用１０００条、２００条和４０条日本血吸虫尾蚴人工攻击感染东方田鼠,金黄地鼠和Ｂａｌｂ／ｃ小鼠,在攻击后第１、２、３、４、７、９、１２、１５、１６、１８、１９、２１、２２、２４、４２天时分别将其剖杀,集虫、观察。结果观察到血吸虫在东方田鼠体内不能发育成熟,在攻击后１９天时虫体已全部死亡。而黄金地鼠和Ｂａｌｂ／ｃ小鼠的虫体回收率分别为６５％和６０．６％。在虫体移行时,东方田鼠肺组织和肝组织     

东方田鼠IgG和IgG3对日本血吸虫抗原反应特性的研究

本文对东方田鼠(Microtus fortis)总IgG和IgG3对日本血吸虫抗原的反应特性进行了研究.纯化东方田鼠IgG,用间接ELISA法检测不同浓度东方田鼠总IgG和IgG3对日本血吸虫童虫可溶性抗原(soluble schistosomula antigen,SSA)、成虫可溶性抗原(soluble adult worm antigen,SWA)、虫卵可溶性抗原(soluble egg antigen,SEA)、童虫不可溶性抗原(insoluble schistosomula antigen,ISSA)、雄虫不可溶性抗原(insoluble male worm antigen,ISMA)、雌虫不可溶性抗原(insoluble female worm antigen,ISFA),以及基因工程抗原rSj14、rSj23-HLD、rSJ28GST、rSjPP的反应情况.结果显示,HRP标记免抗东方田鼠IgG抗体和羊抗小鼠IgG3抗体作为二抗,A值变化规律一致.该结果显示东方田鼠总IgG和IgG3与日本血吸虫抗原可能存在非特异性反应.     

东方田鼠肝脏裂解物筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库

东方田鼠对血吸虫具有天然抗性。为寻找东方田鼠抗血吸虫抗性相关靶基因，探索其分子机理，我们将日本血吸虫童虫与东方田鼠不同组织／器官裂解物共培养，比较它们对血吸虫童虫的杀伤效果，之后，以杀伤效果较好的肝脏裂解物为探针，以亲和淘洗方法筛选日本血吸虫成虫（44d）噬菌体展示cDNA文库。经三轮筛选后，随机挑取92个噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析，获得了19个有效EST序列，其中15条EST序列与已知基因或表达序列标签同源，4个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性，为新的表达序列标签。对19个有效EST编码蛋白的功能预测结果显示，其中6个为卵壳蛋白（Eggshell protein）相关基因，10个EST及其编码蛋白的功能与血吸虫基因表达调控及蛋白质加工修饰相关。研究结果提示，东方田鼠直接或间接地影响血吸虫基因表达，进而影响血吸虫的发育，可能是东方田鼠具有抗血吸虫特性的一个重要分子机理。     

东方田鼠净化的研究初报

东方田鼠隶属仓鼠科(Cricetidae)、田鼠亚科(Microti-nae)、田鼠属(Microtus)。早在上世纪50年代人们就注意到东方田鼠对日本血吸虫具有天然抗感染性〔1〕,近年来随着许多学者对实验室饲养和繁殖的东方田鼠从其遗传学、免疫学等多方位有了较为系统的观察研究〔2~5〕,以期推动东方田鼠抗病基因的重大突破。但要充分利用东方田鼠这一种质资源,则必须对东方田鼠进行实验动物化〔6~8〕,通过将其净化,为抗日本血吸虫机制研究提供安全、理想的动物模型。而东方田鼠的净化工作尚无先例,因此净化方案的确立要综合多方面的因素考虑,既科学又有可操…     

东方田鼠与昆明小鼠胚胎成纤维细胞体外分离和培养比较研究

为了进一步从细胞水平深入研究东方田鼠抗日本血吸虫机制提供试验材料,以及经济可靠地保存野生东方田鼠的生物活性细胞,试验采用胰蛋白酶消化法和组织块贴壁法,分别取妊娠12 d的东方田鼠和昆明小鼠胚胎组织,体外分离、培养成纤维细胞,观察比较不同培养方法、胰蛋白酶浓度、消化时间、传代次数及冻存复苏等因素对分离和培养两种胚胎成纤维细胞的影响,实时观察比较两种细胞生长特性。结果表明:组织块贴壁法和胰蛋白酶消化法均能在体外条件下较好地分离、培养两种胚胎成纤维细胞;采用0.125%胰蛋白酶37℃消化组织10 min,分离的细胞普遍密度大、活力好、贴壁细胞多、速度快,是实验室分离12 d胎龄东方田鼠与小鼠胚胎组织最佳胰酶浓度;昆明小鼠胚胎成纤维细胞较东方田鼠胚胎成纤维细胞足丝长而明显,细胞核较小;两种细胞冻存后生长及活率无显著差异;在含10%血清浓度培养体系中,东方田鼠胚胎成纤维细胞生长速率慢于昆明小鼠胚胎成纤维细胞,生理代数分别为8代和7代,其中2～5代增殖旺盛。说明东方田鼠和昆明小鼠胚胎成纤维细胞在体外分离方法上差异不显著,而两者在生物学特性方面存在一定种属差异。     

东方田鼠肺脏裂解物筛选日本血吸虫成虫噬菌体展示cDNA文库

目的寻找与东方田鼠抗性相关的血吸虫靶基因。方法以东方田鼠肺脏裂解物为探针,亲和淘洗筛选日本血吸虫成虫（44d）噬菌体展示cDNA文库。三轮筛选后．随机挑取76个阳性噬菌体克隆进行序列测定及生物信息学分析。结果共获得了13个有效EST序列,其中8条EST序列与已知基因或表达序列标签同源,5个EST序列与已知基因或表达序列标签均无同源性,为新的表达序列标签。功能预测结果显示．这13个有效EST编码蛋白主要与血吸虫基因表达调控及蛋白质加工修饰相关。结论东方田鼠直接或间接地影响血吸虫基因表达,进而影响血吸虫的发育,可能是东方田鼠具有抗血吸虫特性的一个重要分子机理。     

Characterization of a novel vaccine candidate and serine proteinase inhibitor from Schistosoma japonicum (Sj serpin)

Serine proteinase inhibitors (serpins) represent an important superfamily of endogenous inhibitors that regulate proteolytic events active in a variety of physiological functions. Immunological screening of a Schistosoma japonicum adult worm cDNA expression library with sera of Microtus fortis, a naturally resistant vertebrate host, has identified one clone that encoded for a sequence homologous to those of the serpin superfamily. The full-length sequence encoding S. japonicum serpin (Sj serpin) was amplified from adult worm cDNA by using 5'-RACE-PCR and subsequently cloned into the prokaryotic expression vector pET28c. The full-length Sj serpin fusion-protein with his-tag was expressed in E. coli, purified by affinity chromatography and used to immunize New Zealand white rabbits. Sj serpin is located on the tegument in S. japonicum adult worms. C57BL/6 mice immunized with Sj serpin induced the production of high levels of specific IgE and IgG1 subclass antibodies as well as a marked IL-4 response. Lymphocyte surface marker analysis revealed proliferation of CD19 expressing B cells, indicating a predominant Th2-type response to Sj serpin. Immunized mice developed moderate protection against infection of S. japonicum as demonstrated by a 36 and 39% reduction in the recovery of adult worms and eggs, respectively. These data suggested a role for Sj serpin as a vaccine candidate or as a novel target for anti-schistosome drugs.     

日本血吸虫虫卵在BALB/c鼠肝脏各叶中的分布调查

为建立血吸虫虫卵计数的可准确量化和易于操控的小鼠肝脏取样方法,用日本血吸虫人工感染BALB/c系小鼠42 d后,将肝脏分成左叶、中央叶、右叶,分别进行日本血吸虫虫卵计数。结果显示,感染日本血吸虫42 d的BALB/c小鼠肝脏的平均重量为（2.23±0.26）g。左叶、中央叶、右叶和全肝的每克肝脏含卵数（EPG）分别为49.80×103±26.70×103,59.03×103±29.04×103、36.55×103±17.77×103和47.78×103±23.64×103。各肝叶之间差异有统计学意义（P〈0.05）。可见,血吸虫虫卵在肝脏各叶中的分布是不均匀的,以肝中央叶为最多,肝右叶最少。肝脏EPG与各肝叶中EPG符合线性关系,每对配对成虫对肝脏EGP的贡献从3.67×103到6.5×103个虫卵不等。     

比格犬埃立克体病实验模型研究Ⅰ.血常规及血生化检测

为观察犬埃立克体病急性期血液学变化,对6只人工感染埃立克体的比格犬进行了血常规及血生化检测.采集比格犬感染前后的血液样本,测定血常规及各项血生化指标,并对测定结果作统计学处理.血常规检测发现感染后RBC、WBC、HGB、HCT、PLT、MPV、LYM和MONO值极显著降低(P＜0.01),RDW显著降低(P＜0.05);血生化检测发现感染后ALT和AST极显著升高(P＜0.01),ALB极显著降低(P＜0.01).结果表明,我国犬埃立克体病急性期血液学变化较国外报道的更为明显,这可能与埃立克体中国病原株的致病性不同有关.     

日本血吸虫钙网织蛋白在Sf9昆虫细胞中的表达及其活化树突细胞的初步分析

为获得在Sf9昆虫细胞中表达的日本血吸虫钙网织蛋白(Schistosoma japonicum calreticulin protein,SjCRT)并分析其活化小鼠骨髓来源树突状细胞的功能,将构建的重组杆状病毒转移载体pFastBacHTA-SjCRT转入DH 10Bac细胞,得到重组穿梭质粒reBacmid-SjCRT,再转染到Sf9昆虫细胞,进行重组蛋白的表达.用Westem blot和间接免疫荧光对表达蛋白进行鉴定.His柱亲和层析法纯化表达的蛋白,Westen blot鉴定纯化后的蛋白.从BALB/c小鼠产生骨髓来源的树突细胞mDCs,用纯化的重组SjCRT蛋白与mDCs共培养,流式细胞术检测mDCs细胞的表面分子MHCⅡ、CD40和CD86的表达.结果显示,在Sf9昆虫细胞中成功表达了SjCRT蛋白;纯化后的重组SjCRT蛋白既能被感染日本血吸虫42 d的兔阳性血清识别,也能被原核表达的重组SJC RT蛋白免疫鼠的血清所识别.流式细胞术结果显示,与对照组的相比,SjCRT蛋白刺激组mDCs细胞表面分子MHCⅡ和CD86的表达量显著增强(P＜0.05).可见,在Sf9昆虫细胞中表达的SjCRT蛋白能刺激小鼠骨髓来源树突细胞表型的成熟.     

日本血吸虫含EF手性结构域分子序列的分析和初步鉴定

为分离鉴定日本血吸虫含EF手性结构域分子及分析其序列结构特征，首先找到含有EF—hand结构域的分子，按照序列一级结构进行分类，之后进行生物信息学分析。然后用PCR方法以虫卵和成虫cDNA文库为模板扩增分类后的分子，构建重组质粒，诱导蛋白表达并纯化，选取14个纯化蛋白用Western blot进行初步免疫原性鉴定。结果269个原始含EF-hand结构域分子按照序列一级结构分为70个；成功表达和纯化了49个含EF手性分子，进化树分析将其分为9类；Western blot显示，14个纯化蛋白均可被日本血吸虫感染小鼠阳性血清识别。本研究结果为下一步采用这类分子进行动物保护性效果评价以及保护性免疫机制的研究奠定了基础。