鸡IL-18基因重组真核表达载体的构建及其表达产物的生物学活性

从pMDChIL-18克隆质粒扩增获得了ChIL-18全基因片段，并将其重组到真核表达载体pcDNA3．1( )。经酶切、质粒PCR鉴定和基因测序，鸡IL-18全基因被正确重组到pcDNA3．1( )真核表达质粒上；将重组真核表达质粒pcDNA3．1( )-ChIL-18转染COS-7细胞，转染细胞中含ChIL-18基因的mRNA。SDS-PAGE分析表明，表达产物是与ChIL-18相符的约23ku的蛋白条带。鸡淋巴细胞转化试验表明，表达产物对鸡淋巴细胞具有明显诱导转化作用。     

PRRSV变异株ORF6基因与IL-18共表达真核质粒的构建及其表达

针对白细胞介素18(IL-18)基因和本实验室分离的PRRSVJL/07/SW毒株全基因序列,分别设计了2对特异性引物,扩增出IL-18基因和ORF6基因。将2个目的基因克隆于真核表达载体pEGFP-N1中,成功构建了重组真核质粒pEGFP-ORF6和pEGFP-IL18-ORF6,阳性质粒转染Marc-145细胞进行筛选。通过表达载体在转染细胞中的高效转染,增强型绿色荧光蛋白(EGFP)快速、准确的反映出阳性质粒在细胞质中的正确表达,再通过SDS-PAGE和Western blot鉴定构建的真核表达质粒pEGFP-IL18-ORF6的正确性。结果表明,ORF6基因和IL-18基因在Macr-145细胞中能有效表达。结论,所构建的真核质粒pEGFP-IL18-ORF6结构正确,能够在Marc-145细胞中高效表达,而且表达产物具有特异免疫学反应。     

鸡IL-18成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性分析

为了找到一种获得鸡白细胞介素-18(IL-18)活性蛋白的简便方法,试验采用基因工程的方法,以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板进行RT-PCR扩增,克隆鸡IL-18成熟蛋白基因并进行序列分析。将鸡IL-18成熟蛋白基因克隆至原核表达载体pGEX-KG,构建原核表达质粒,通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组鸡IL-18蛋白在大肠杆菌中的表达,经葡聚糖凝胶层析柱纯化后,用3-(4,5)-双甲基-2-噻唑-(2,5)-二苯基溴化四氮唑蓝(MTT)法检测表达重组蛋白的生物学活性。结果表明:鸡IL-18成熟蛋白基因开放阅读框为510 bp,编码170个氨基酸;所获得的鸡IL-18成熟蛋白基因与GenBank中鸡IL-18的核苷酸同源性为99.0%～99.8%,氨基酸同源性为97.5%～99.5%;成功地构建了pGEX-IL-18原核表达质粒,表达的重组蛋白质量约为45.6 ku,该重组蛋白具有明显增强鸡脾淋巴细胞增殖的生物学活性。     

用DNA免疫研制鸡白细胞介素2单克隆抗体

构建鸡白细胞介素2(鸡IL-2)的真核重组质粒pcDNA-IL-2和原核重组质粒pET-IL-2,以重组质粒pcDNA-IL-2免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,以重组质粒pET-IL-2在大肠杆菌BL21(DE_3)中诱导表达的蛋白作为筛选抗原,通过间接ELISA法对杂交瘤进行筛选,经亚克隆后共获得3株针对鸡IL-2的特异性单克隆抗体,并对这3株单克隆抗体的特性进行了鉴定。     

鸡毒霉形体H3株TM-1基因与鸡白细胞介素2基因串联子在大肠杆菌中的共表达

运用DNA重组技术将鸡白细胞介素2基因和鸡毒霉形体H3株TM-1基因进行串联,插入到pET-30a（＋）质粒的EcoRⅠ和HindⅢ多克隆位点间,经PCR鉴定、双酶切鉴定和序列测定,表明已成功构建了含鸡毒霉形体H3株TM-1基因和鸡白细胞介素2基因的融合基因,将含有此融合基因的重组质粒命名为pET-30a（＋）-TM-1-IL-2.将此重组质粒转化E.coli BL21（DE3）菌株.经IPTG 37℃诱导表达4 h后,SDS-PAGE电泳结果显示,此融合基因得到了表达,所表达出的融合蛋白的分子质量约为43 ku,主要以包涵体形式存在.表达产物在尿素存在下经超声波处理,获得了纯化的融合蛋白.这为进一步研究鸡白细胞介素2及鸡毒霉形体的生物学活性奠定了基础.     

鸡防御素基因GAL-2的克隆及其真核表达载体的构建

采用RT-PCR方法从15日龄的仔鸡肾组织的总RNA中扩增出鸡防御素基因(GAL-2)序列,然后将其亚克隆到载体pIRES2-EGFP构建成真核表达载体pIRES2-EGFP-GAL-2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到Marc145细胞中进行瞬时表达,荧光检测证实细胞转染成功。pIRES2-EGFP-GAL-2真核表达载体的成功构建为下一步在细胞水平研究GAL蛋白功能以及进一步将其开发为兽用生物制品奠定了基础。     

猪圆环病毒Ⅱ型贵州分离株ORF2基因表达的试验

通过采集疑似猪圆环病毒感染的病料,分离到1株猪圆环病毒2型贵州株,并对其进行了鉴定。原核表达试验结果表明,PCV-2贵州株的ORF2基因可在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达的目的蛋白约为40.0 k Da,且复性蛋白具有一定免疫原性。将真核表达质粒分别转染PK-15细胞,以掌握ORF2基因和白细胞介素-2(IL-2)基因体外表达情况;将重组质粒、空载体及生理盐水分别免疫BALB/c小鼠,以监测血清中特异性抗体及T淋巴细胞亚群含量,从而探讨猪圆环病毒Ⅱ型贵州分离株ORF2基因真核表达效果及长白猪细胞因子IL-2对PCV2 ORF2免疫原性的影响,结果表明,pc DNA3.1-ORF2和pc DNA3.1-ORF2-IL-2在PK-15细胞中获得了较高的表达,IL-2可明显增强PCV-2 DNA免疫效果。     

鸡IL-2受体α亚基成熟蛋白基因的克隆及其胞外段的原核表达

以鸡脾淋巴细胞总RNA为模板，采用RT—PCR方法克隆了鸡白细胞介素-2受体α亚基（ChIL-2Rα）编码区基因。将ChIL-2Rα胞外段基因克隆到pET-32a（＋）中，获得重组质粒pET32a—exChIL-2Rα，转化宿主菌E．coli Rosseta^TM（DE3）后，经IPTG诱导表达的融合蛋白大小约为34ku。序列分析发现，鸡IL-2Rα编码区基因与GenBank上已登录序列的核苷酸同源性为99．2％，氨基酸同源性为99．5％。ChIL-2Rα与其他哺乳动物IL-2Rα在核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为29．6％～54．5％和18．8％～28．0％。表明，禽类IL-2Rα与哺乳类的差异较大。     

荣昌猪白细胞介素-2基因的原核表达

应用DNA重组技术,将克隆的荣昌猪白细胞介素-2基因亚克隆到PET-32a( )表达载体上,构建重组表达载体。酶切鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,用1 mM的HPTG诱导表达重组蛋白。RT-PCR方法检测表明白细胞介素-2基因得到了转录;对表达蛋白进行SDS-PAGE电泳,发现在相对分子质量约37 Ku处有明显的蛋白质条带,而对照组无相应条带产生。最后用MTT法检测表达蛋白的生物学活性,表明所获得的重组蛋白具有较好的生物学活性,这为利用该蛋白及其基因研制高效抗病免疫制剂和基因工程疫苗奠定了良好的基础。     

猪白细胞介素2基因的克隆和酵母表达

以伴刀豆球蛋白A（ConA）诱导的猪外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增出约500 bp的DNA片段,对阳性克隆进行测序与分析。结果：所克隆的基因与GenBank上公布的猪白细胞介素2（PoIL-2）基因的同源性为100%,表明试验成功获得了PoIL-2基因的全序列克隆;以该重组质粒为模板进行PCR,扩增出PoIL-2成熟蛋白的基因片段,连接真核表达载体pPICZαA,成功地构建了重组PoIL-2成熟蛋白基因的真核表达载体pPICZαA-PoIL-2;电转化pPICZαA-PoIL-2于巴斯德毕赤酵母X-33,诱导表达后进行表达产物的SDS-PAGE鉴定,结果表明试验成功地建立了重组PoIL-2的酵母表达系统。     

鸡白细胞介素2原核表达载体的构建及表达产物的鉴定

将鸡白细胞介素2(IL-2)的cDNA克隆到原核表达载体pET-30a( )上，构建原核重组表达质粒pET-IL-2，并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，37℃用IPTG诱导3.5h后，SDS-PAGE检测表明，表达蛋白以包涵体的形式存在。将诱导后的工程菌超声波裂解，离心后的沉淀用PBS洗涤5～6次，得到高纯度的目的蛋白。     

鸡白细胞介素2分子单克隆抗体的研制

以含有鸡白细胞介素2（ChlL-2）基因的重组真核表达质粒pcDNA3．1-ChlL-2免疫6周龄BALB／c小鼠,末次加强免疫后取其脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2／0-Ag-14融合,应用间接ELISA筛选阳性克隆。共获得2株特异性分泌抗鸡IL-2分子的杂交瘤细胞株,分别命名为1H10和1E6,其腹水ELISA效价分别为1：6400和1：3200,亚类鉴定结果均为IgM。重组质粒pcDNA3．1-ChlL-2转染COS-7细胞,以上述单克隆抗体（mAb）检测表达产物,结果表明,2株mAb均能与表达产物反应;Western blot分析结果显示,2株mAb均与原核表达鸡IL-2蛋白发生特异性反应。本研究所制备的抗鸡IL-2分子mAb可为建立简单、快速的鸡IL-2检测方法提供可能,并为鸡IL-2生物学特性和禽类细胞免疫机理的研究提供材料。     

鸡IL-2和新城疫病毒HN基因在毕赤酵母中的融合表达

为进一步研究IL-2对疫苗的免疫增强作用,本研究经PCR扩增分别获得鸡IL-2和新城疫病毒(NDV)HN基因片段,应用分子克隆技术获得含有融合基因IL2-HN的真核表达载体pPICZαA-IL2-HN,重组质粒pPICZαA-IL2-HN线性化后整合入毕赤酵母X-33染色体上,在甲醇诱导下表达融合蛋白,再进行SDS-PAGE、Western-blot检测。SDS-PAGE分析结果表明目的蛋白为分泌性表达,分子量约为100 ku,Western-blot结果表明目的蛋白具良好的免疫反应性。     

口蹄疫病毒VP2基因的真核表达及其产物抗原性的检测

利用PCR技术，扩增出口蹄疫病毒（FMDV）VP2基因，并克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A上。用重组质粒pB-VP2与重组病毒同时转染sf9昆虫细胞，获得了重组病毒。经过蚀斑筛选纯化后，感染sf9细胞，表达VP2融合蛋白，分子质量为33ku左右。以牛抗O型FMDV血清为第一抗体，通过Western-blotting和Dot-ELISA鉴定，说明VP2基因在真核表达系统中获得正确表达，且可以与牛抗。型FMDV血清发生特异性反应。     

鸡IL-2基因的克隆及GST-chIL2融合蛋白的表达

根据Sundick等发表的鸡IL-2基因(chIL2)序列设计合成特异性引物,用RT-PCR从ConA诱导的鸡脾淋巴细胞扩增出450 bp的目的片段,酶切鉴定及序列测定结果表明为鸡IL-2基因。该基因包括鸡IL-2基因的全部开放阅读框,编码142个氨基酸组成的蛋白质,与GenBank鸡IL-2基因相比,在编码氨基酸的49位有一个氨基酸缺失;而与Broiler、SC、Chenren和Xiaoshan鸡在编码氨基酸上完全一致,具有较近的亲缘关系;与Kestrel来航鸡、来航SPF鸡、Obese、Silky和Xianju鸡等有1-4个氨基酸的差异;与火鸡和鹌鹑的氨基酸同源性分别为69.9%和59.4%。将克隆到的基因插入到融合蛋白原核表达载体pGEX-6p-1中,得到重组表达质粒pGEX-IL2。将此重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经IPTG诱导,表达出了大小约为40 ku的GST-chIL2融合蛋白,其中GST部分为26 ku,鸡IL-2为14 ku,与预期的鸡IL-2成熟蛋白大小一致。     

真核表达质粒pcDNA.3.1(+)-ACE2的构建及其在CHO细胞中的表达

为了构建pcDNA.3.1(+)-血管紧张素转化酶2(ACE2)真核表达质粒并检测在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达,从羊肾脏中提取总RNA,经RT-PCR扩增出ACE2基因,后将其与pcDNA3.1载体进行连接重组,构建pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒,经HindⅢ、XhoⅠ限制性内切酶双酶切及DNA序列测序分析等方法验证后,通过Lipofectamine 3000脂质体介导转染至CHO细胞,Western blot法检验ACE2基因在蛋白质水平上的表达。结果显示:RT-PCR扩增出大小约为2 200 bp特异ACE2基因片段,连接获得的pcDNA3.1(+)-ACE2重组体经HindⅢ、XhoⅠ酶切后分别出现约2 200 bp和5 000 bp片段,测序分析与Gen Bank上公布的结果完全一致,表明成功克隆了重组pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒,Western blot检测显示该pcDNA3.1(+)-ACE2能在CHO细胞中表达。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ACE2真核表达质粒,并证实其能在CHO中表达,为后续探究ACE2蛋白活性及其作用的研究奠定了基础。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因真核细胞表达载体的构建及免疫应用研究

应用DNA重组技术将含有IBDV保护性抗原VP2质粒，以EcoRI、xhoI酶切，将酶切得到的VP2基因移入到载体pcDNA3CMV启动子下游，得到含有IBDV VP2基因的真核表达载体pcD-VP2基因疫苗。pcDVP2体外转染细胞能正确表达目的的蛋白，免疫雏鸡后20d，在体内可检测到特异性抗体。     

鸭的类似鸡白细胞介素2基因的克隆及遗传进化分析

通过RT—PCR和DNA测序技术，克隆和测定了绍兴麻鸭的一种类似鸡白细胞介素2(IL-2)基因的核苷酸序列，并构建了该基因编码蛋白的三维结构分子模型。结果显示，绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因的核苷酸长度由748个碱基组成，编码产物为由140个氨基酸残基组成的多肽，编码产物中含有21个氨基酸残基组成的信号肽。绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因的核苷酸及编码产物，与鸡和火鸡IL-2的一致性分别为71.4％～72．1％和55．0％～57．9％，与哺乳类等动物IL-2的一致性分别为22．1％～28．8％和14．3％～17．1％。对绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因蛋白编码产物的系统进化树分析表明，其编码产物与鸡和火鸡IL-2具有较远的亲缘关系。绍兴麻鸭的类似于鸡IL-2基因编码产物的三维结构，预测由4个α-螺旋结构和2个β折叠组成。这些研究结果预示。鸭的类似于鸡IL-2基因编码产物，在生物学功能上与哺乳动物和其他禽类具有很大的差异。     

鸡白细胞介素-18基因的原核表达及多克隆抗血清的制备

将编码鸡白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)成熟蛋白的基因亚克隆至原核表达载体pPROEXTMHT中，构建重组质粒并进行确证性序列测定。然后将重组质粒转化大肠杆菌DH5α并用IPTG于37℃诱导培养。表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在，目的蛋白表达量占菌体蛋白的30％。SDS-PAGE和Western blot分析显示，表达的鸡IL-18融合蛋白相对分子质量约为23000。包涵体被6mol／L盐酸胍裂解后，通过镍离子亲和树脂进行了纯化。用所获得的重组鸡IL-18融合蛋白及其纯化产物经3次肌肉注射豚鼠，制备豚鼠抗鸡IL-18多克隆抗血清，并用琼脂扩散试验多克隆抗血清进行了证明。本试验成功的原核表达、纯化了鸡IL-18融合蛋白，并制备了抗鸡IL-18多克隆抗血清，为下一阶段关于鸡IL-18重组蛋白生物学特性及其应用的研究打下了坚实的基础。     

山羊IL-2的体外表达及其多克隆抗血清的制备

应用RT-PCR方法从山羊外周血淋巴细胞中克隆了山羊白细胞介素-2(Caprine interleukin-2,CapIL-2)基因并进行测序,将编码山羊IL-2蛋白的基因亚克隆至pET30a( )上,转化大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG于37℃诱导培养。表达融合蛋白通过ProBondTM蛋白纯化试剂盒纯化。纯化产物经3次免疫新西兰白兔,制备出山羊IL-2抗血清。本次试验成功地表达、纯化了山羊IL-2,并制备出兔抗山羊IL-2抗血清,为下一步开展山羊IL-2重组蛋白的应用研究奠定了基础。