新型鹅星状病毒的分离鉴定与全基因序列分析

为了解近年鹅星状病毒的流行情况,通过鹅胚接种、鹅胚半数致死量测定(ELD_(50))、RT-PCR检测和基因组序列测定等方法,从2019年山东某养鹅场雏鹅疑似星状病毒引起鹅内脏痛风病的病料中分离出1株新型鹅星状病毒,命名为AstV/Goose/SD776/2019。该分离株能引起鹅胚典型的临床症状,病毒无血凝活性,ELD_(50)为10~(-4.0)/0.2 mL,动物回归试验中死亡的雏鹅可以复制出与临床自然感染相似的病变。用RT-PCR对分离株全基因组序列分析结果显示,分离株的3个ORF和与新型鹅星状病毒毒株(JSHA、SD01、SDPY、GD)的核苷酸和氨基酸同源性较高(99.2%以上);与能导致雏鹅肠炎的鹅星状病毒(FLX)及其他种属禽源星状病毒同源性相对较低,遗传进化分析结果显示,分离株在进化树上与4株新型鹅星状病毒的亲缘关系接近,表明分离毒株为新型鹅星状病毒。     

利用宏病毒组学对鹅痛风病原的鉴定

为确定2020年江苏盐城一鹅场雏鹅痛风的病原,试验对病料样品进行宏病毒组测序,通过比对分析原始数据发现疑似病原;通过从头组装获得其全基因组序列,并进行相似性比对和遗传进化分析;通过对疑似病毒的分离、鉴定和动物回归试验进行验证。宏病毒组学测序结果显示,在获得的全部599 733条原始读长(reads)中,病毒reads有278 593条,其中鹅星状病毒序列占95%,未发现其他疑似病毒序列;经从头组装获得了一条完整的鹅星状病毒全基因组序列,命名为YC20,该病毒基因组全长7 137 nt,GenBank登录号为:MW536497,基因组结构及特征与其他星状病毒相同。全基因组序列相似性比对结果显示,YC20与新型鹅星状病毒SD01相似性最高,达98.2%;遗传进化分析结果显示,YC20与其他新型鹅星状病毒在同一分支,属于新型鹅星状病毒。禽胚分离结果显示,用鹅胚进行病原分离时,前3代次未出现死亡,第5代次后,可对鹅胚100%致死,而用SPF鸡胚或SPF鸭胚分离病原时,均未出现病变或死亡,PCR检测亦为阴性;纯化的尿囊液经负染后,电镜下可见大小约25 nm的病毒粒子。雏鹅回归试验结果显示,YC20接种3日龄雏鹅后,第6~8天出现死亡高峰期,死亡率为58.3%,剖检死亡鹅可见心脏、肝脏表面覆盖一层白色包膜,膝关节有大量白色颗粒样沉淀,肾脏充血肿大。以上结果说明,该鹅场痛风的病原为新型鹅星状病毒。本研究将宏病毒组学与传统的病毒分离鉴定技术相结合,证实了鹅痛风的病原,对病原的鉴定和研究具有指导意义。     

一株鹅星状病毒的分离鉴定

为了研制预防鹅痛风病的鹅星状病毒(Goose astrovirus,GAstV)疫苗及卵黄抗体,试验对黑龙江省某养鹅场疑似痛风死亡鹅的肝脏及肾脏组织进行了病原分离,并对分离病毒进行了鹅胚传代、RT-PCR检测、核苷酸序列测定与比对、病毒含量测定及动物回归试验。结果表明:试验分离得到一株鹅星状病毒;分离毒株可致传代鹅胚100%死亡;鹅胚传代尿囊液的RT-PCR检测为阳性;阳性产物核苷酸序列与鹅星状病毒AHDY株基因(登录号为MH410610.1)和FLX株基因(登录号为KY271027.1)核苷酸序列的同源性分别为98%和93%;分离株病毒含量为1×10~(4.83)ELD_(50)/0.2 mL;2日龄健康易感雏鹅接种分离毒株48 h后陆续死亡,剖检表现为心脏、肝脏与输尿管尿酸盐沉积及肾脏出血肿胀,与自然发病雏鹅症状一致。说明该分离毒株为导致雏鹅痛风病的病原,可作为研制鹅星状病毒疫苗及卵黄抗体的候选毒株。     

一株鹅星状病毒变异毒株的基因组特征与致病性分析

旨在研究引起雏鹅痛风的新型鹅星状病毒流行株特征。本试验从安徽省鹅星状病毒阳性雏鹅组织中进行病毒分离,并对分离的毒株进行全基因组测序,随后进行遗传进化分析。结果表明,病毒液接种9~11日龄鹅胚可成功分离到病毒,将其命名为GASTV-ZM株。IFA （indirect immunofluorescence assay）鉴定为阳性。基因组序列分析表明,ZM株鹅星状病毒基因组全长7 175 nt,ORF2基因核苷酸和氨基酸与2014—2020年间分离毒株的同源性分别为96.7%~98.9%和96.9%~99.0%,ORF2基因编码的氨基酸序列结果显示,3个氨基酸突变位点与以往存在显著差异,ZM株与2016年以来在我国流行的新型鹅星状病毒处于同一进化分支,与2020分离株HNSQ-6株和XT1株同源性较高。本研究为进一步研究该病毒的致病性和致病机理奠定基础。     

我国部分地区新型鹅星状病毒ORF2基因序列及遗传变异分析

为掌握我国新型鹅星状病毒(goose astroviruses,GoAstV)的遗传变异方向,对2019年从我国不同地区发病鹅病料中分离到的10株新型GoAstV,采用PT-PCR技术扩增其ORF2基因,然后进行测序和遗传进化分析。结果显示:分离毒株ORF2基因全长2 115 bp,编码705个氨基酸;毒株间核苷酸和氨基酸同源性分别为96.2%～99.9%和96.3%～99.9%;分离毒株与参考毒株Goose/SDPY/1116/17亲缘关系最近,处于同一分支。将分离毒株ORF2氨基酸序列与参考毒株进行比较后发现,该基因编码的衣壳蛋白氨基酸序列有多处位点存在差异,表明当前我国GoAstV流行毒株已发生变异。本研究为后续新型GoAstV的分子生物学特性研究及其疫苗研制提供了参考。     

导致雏鹅痛风新型鹅星状病毒的分离鉴定

2017年2-12月,我国山东、安徽、江苏、辽宁、河南及广东等地雏鹅群暴发了一种以痛风为主要特征的传染性疾病。该病主要发生于5~20日龄的雏鹅,病鹅内脏器官及关节腔发生严重的尿酸盐沉积,死亡率最高可达50%,给养鹅业造成了巨大的经济损失。为确定引起该病的病原,本试验对在全国各地采集的143份样品进行了实验室检测及病原的分离鉴定。检测结果显示,禽星状病毒阳性检出率达96.5%(138/143)。对山东平原分离株(SDPY株)ORF1b基因进行了遗传进化分析,结果表明该分离株与已报道的鸡源、火鸡源、鸭源及鹅源星状病毒亲缘关系较远,核苷酸同源性仅为49.5%~67.7%。动物回归试验结果显示,1日龄健康雏鹅于接种SDPY株24h后陆续死亡,剖检表现为心脏、肝脏、肺脏、肾脏等内脏器官及关节腔的尿酸盐沉积与肾脏的出血肿大,与自然发病症状一致。由此确定,导致雏鹅痛风病的病原为新型鹅星状病毒。     

鹅细小病毒强毒株XKY10株的分离、鉴定及其生物学特性分析

采用电镜观察、PCR检测、血液凝集和琼脂扩散方法来鉴定从白城某养鹅场10日龄雏鹅具有典型症状的雏鹅肝脏、脾脏和肠组织中分离的一株病毒;通过测定此病毒最小致死量致死鹅胚的平均时间(MDT)和鹅胚半数致死率(ELD₅₀)来分析其毒力。鉴定结果表明,该病毒为鹅细小病毒。毒力分析结果表明,该毒株为强毒株。     

广东地区致雏鹅痛风鹅星状病毒的鉴定及遗传演化分析

为了解广东地区鹅星状病毒(GoAstV)的流行和变异情况，本研究于2019年～2021年从广东清远、广州、江门和汕尾4个地区采集83份疑似患痛风雏鹅的肝脏和肾脏病料样品。制备的组织病理切片结果显示，痛风雏鹅肝脏和肾脏组织出现大量的炎性细胞浸润和细胞坏死，经RT-PCR检测鉴定到其中72份样品为Go AstV阳性。从4个地区各选1份阳性样品对鉴定到的Go Ast V进行全基因组的PCR扩增，结果显示获得4株长度均为7 033 bp的Go AstV全基因组序列。采用Meg Align分析的核苷酸同源性结果显示，4株Go Ast V全基因组序列的同源性为98.4%～99.4%，与报道的Go AstV-2参考株全基因组序列的同源性为97.1%～99.7%，而与Go AstV-1全基因组序列的同源性仅为57.3%～57.7%。与其他禽星状病毒相比，Go AstV与火鸡星状病毒2型(TAstV-2)的同源性最高，其全基因组序列同源性约为65.0%～65.3%。Cap蛋白的氨基酸序列分子特征分析结果显示，4个鉴定株Cap蛋白的氨基酸序列均发生了Y36H突变，其中Go Ast V/Guangdong/...     

新型鹅星状病毒致雏鹅痛风及其综合防控

2017年起,我国主要养鹅地区雏鹅群暴发了以关节和内脏器官尿酸盐沉积为特征的雏鹅痛风,相关研究表明引起此次雏鹅痛风的病原是一种新型鹅星状病毒(GoAstV)。近年来,GoAstV在我国雏鹅群广泛流行,给我国养鹅业造成极大损失。本文将从病原学、流行病学、临床症状、病理变化、诊断、疫苗研究进展以及综合防控措施对雏鹅痛风进行阐述,以期为小鹅痛风的防控提供参考。     

鹅星状病毒的分离鉴定及其在雏鹅体内的分布规律

研究目的旨在鉴定引起雏鹅痛风病的病原,并观察其在雏鹅体内主要器官中的分布、持续时间以及排毒周期。通过鹅胚绒毛尿囊膜接种法分离病原,利用RT-PCR检测、电镜观察、动物回归、基因序列分析等方法确定该病毒为鹅星状病毒,命名为GAstV-AH;利用RT-PCR方法检测该病毒在雏鹅体内的分布,以及病毒的排毒周期。受试雏鹅临床病理变化显示,患鹅肾脏苍白肿大,心脏、肝脏呈现尿酸盐沉积为主要特征的病变;自病死雏鹅的肝、肾组织中分离得到1株病毒,该分离毒能致死鹅胚,致死率约为40%～60%,死亡鹅胚出现绒毛尿囊膜增厚、胚体充血并伴有生长抑制;电镜观察,死亡鹅胚尿囊液中病毒粒子呈球状,无囊膜,直径约为28～30 nm;该病毒人工感染1日龄雏鹅后可复制出与临床自然发病雏鹅相同的临床症状和病理变化,并能从发病组织中分离到病毒;分离毒对氯仿、胰蛋白酶等制剂不敏感,对热处理稳定,对酸稍不稳定;该病毒核酸为单链RNA,由3′UTR、5′UTR,ORF1a、ORF1b、ORF23个开放阅读框和一个poly(A)尾组成,将ORF2编码的氨基酸进行进化树分析发现,其与已发表的3株鹅星状病毒同源性在98.5%～99.2%;该病毒在实验室条件下感染雏鹅,在感染后2～12 d能检测到排毒,12 d后停止排毒,直至30 d未再次出现排毒;感染鹅的心、肝、脾、肺、肾脏在攻毒后2～8 d内,RT-PCR法对病毒的检出率为100%,12～16 d的检出率为50%～70%,20～30 d后不再检出该病毒,肠中未检出该病毒。     

Isolation,Identification and Complete Genomic Sequence Analysis of Goose Astrovirus

From October 2017 to May 2019, 67 samples of typical goslings gout were collected from Guangdong, Sichuan, Hebei, Shandong, Anhui, Liaoning provinces and other vast goose-raising areas in China. The results showed that goose astrovirus was detected in all samples and about 94.03% of the samples were infected by two different kinds of goose astrovirus. The pathogenicity of goose astrovirus FLX variant strain (named SCCD) which could stably proliferate in goose embryos and kill 10-day-old goose embryos was more virulent than goose astrovirus FLX strain. The new type of goose astrovirus strain (named SDPD) could't stably proliferate in goose embryos and SPF chicken embryos. The whole genome nucleotides homology of goose astrovirus FLX strain with goose astrovirus SCCD strain and the new type goose astrovirus SDPD strain were 89.7% and 58.1%, the amino acids homology of ORF1b gene were 98.4% and 61.0%, the amino acids homology of ORF2 gene were 81.0% and 42.5%, respectively. The newly isolated goose astrovirus strains were inoculated into 1-day-old healthy goslings, the results showed that although the goose astrovirus SCCD strain and the new type goose astrovirus SDPD strain could cause the death of goslings and the changes of hepatitis, kidney swelling and weight loss, none of the goslings showed typical gout characteristics (urate deposition in the organs of the body), however, 44% of goslings were characterized with typical gout which was consistent with the symptoms of natural disease after coinfected by the two goose astrovirus strains. Therefore, the pathogenic agents of goslings gout may be two different kinds of goose astrovirus, namely the new type of goose astrovirus and the variant of goose astrovirus FLX.     

鹅细小病毒QY株的生物特性研究

本研究的病毒是从广东患病鹅的小肠组织中分离的,初步鉴定为小鹅瘟病毒(Goose parvovirus,GPV),命名为QY/05后,对病毒的生物学特性进行了鉴定。病料经过处理后,接种12日龄非免疫鹅胚,传代,发现病毒对鹅胚的平均致死时间为3～4d,胚体全身出现较为严重的出血点。病毒接种鹅成纤维细胞和番鸭成纤维细胞,显微镜下可见细胞圆缩、脱落、折光性增强等明显的细胞病变。鹅胚尿囊液经梯度离心后,磷钨酸负染,电镜下可见明显细小的病毒样粒子。这株小鹅瘟病毒尿囊液对鹅胚的EID50为10-3.67/0.3ml。对鹅胚成纤维细胞的TCID50分别为2-5.425/0.1ml。感染一个病毒最小致死量的鹅胚平均死亡时间(MDT)分别为96h。提取DNA后,PCR扩增,在阳性对照处扩增出需要的目的条带。研究结果表明,该分离毒株为典型的鹅细小病毒(Goose Parvovirus,GPV)。     

鹅源禽副粘病毒NA-1株HN蛋白基因的遗传变异研究

鹅副粘病毒分离株NA-1株经11日龄鸡胚增殖后纯化。提取病毒的基因组RNA，采用RT-PCR扩增出与预期设计的1．7kb大小相符合的特异条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体，经纯化、筛选及酶切鉴定后，初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆，并对阳性克隆进行了测序。测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1740bp，该基因的ORF总长为1716bp，编码571个氨基酸。与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列，发现所测NA-1株与国内标准强毒株F48E9核苷酸的同源性为84．5％，氨基酸的同源性为89．5％；与传统的疫苗株La Sota核苷酸的同源性为82．2％，氨基酸的同源性为88．5％；与鹅源禽副粘病毒SF02株核苷酸的同源性为97．1％，氨基酸的同源性为97．4％；与鹅源禽副粘病毒YG97株核苷酸的同源性为97．3％，氨基酸的同源性97．4％。说明NA-1株和SF02株、YG97株亲缘关系较近，它们三者可能有着共同的来源。根据基因树分析，NA-1株应属于基因VII型新城疫病毒。由此更进一步证实新城疫可以感染水禽，且对鹅具有高度的致死性。     

鹅细小病毒HN株的分离鉴定及全基因组序列分析

为研究鹅细小病毒(GPV)基因遗传变异特征,采集海南某养鹅场疑似鹅细小病毒感染的病料,将其处理后接种番鸭胚成功分离到一株病毒,经PCR鉴定为鹅细小病毒,命名为HN株,并获得了其全基因组序列,将该序列与GenBank数据库中登录的16条鹅和番鸭细小病毒基因序列进行了比对分析。结果显示,该株病毒基因组全长为5 106bp,由ITR、NS、VP构成,其中ITR为444bp,NS1为1 844bp,VP1为2 199bp;HN株与SHFX1201株的NS1基因和VP1同源性最高,分别达到99.8%和99.7%,与番鸭细小病毒株FM的NS1基因同源性最低,为82.7%;与90-0215株VP1同源性最低,为80.1%。HN株的遗传进化树可以看出,GPV可以分成明显的2个基因亚群,HN株与鹅细小病毒匈牙利株(B)、欧洲疫苗株(VG32/1)和台湾株(82-0321V、82-0321、06-0329)均处在第I亚群,且与安徽分离株Y株以及SHFX1201株同源性最接近,番鸭源匈牙利株FM单独处于第Ⅱ亚群。本研究丰富了GPV的数据资料,为研究GPV分类地位以及遗传进化关系提供了依据,同时也为研究GPV流行趋势和疫苗的开发奠定了基础。     

两株猪繁殖与呼吸征病毒的分离鉴定及遗传变异分析

从广东省发病猪场采集的组织和血清中分离到两株PRRSV,病料经RT-PCR检测为阳性,通过Marc-145细胞进行传代,可产生明显细胞病变,通过间接免疫荧光可检测到荧光信号,两株病毒分别命名为ZH-GD株和ZS-GD株。对两株病毒的ORF5和Nsp2高变区进行序列测定和分析,结果表明,PRRSV ZH-GD株和ZS-GD株的核苷酸序列与欧洲型代表株LV株间的相似性相对较远,与美洲株经典毒株VR-2332间的相似性分别为88.6%和88.1%,与中国经典美洲毒株CH-1a间的相似性分别为94.4%和93.0%。在Nsp2上有30个氨基酸的缺失,与JXA1、XH-GD等高致病性变异株的Nsp2缺失位置一致。分离的两株PRRSV均属于美洲型的变异株PRRSV。     

2株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离、鉴定及遗传进化分析

Two strains of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses (PRRSV) were isolated from serum of some pig farms in Guangdong province and showed PRRSV positive in RT-PCR testing. The two viruses could passage stably and cause typical cenotaphic effect, they were named as LZ-GD and LB-GD. The analysis of variable region sequences of ORF5 and Nsp2 of the two viruses showed that LZ-GD and LB-GD strains were far to Europe strain Lelystad, the homology of nuclear nucleotide sequence were 63.5% and 63.8%, respectively, with classic American strain VR-2332 were 88.7% and 89.1%, respectively, and that with highly pathogenic JXA-1 strain were 99.2% and 99.3%, respectively. There were 30 amino acids deletion in Nsp2. It shared the deletion with JXA-1, HUN4 and other pathogenic variant. Thus, the two strains of PRRSV belonged to highly pathogenic American type.     

FPV在鹅胚上的驯化及部分TK基因的克隆与序列分析

通过将禽痘病毒接种15日龄鹅胚的绒毛尿囊膜的方法对其进行驯化,使其适应鹅胚,并出现典型病变;再以驯化第9代的病毒接种16日龄雏鹅,通过PCR的方法在接种后10d的鹅血液中检出病毒。根据已发表的禽痘病毒TK基因序列设计1对引物,采用PCR技术扩增出与预期设计的600bp大小相符的TK基因片段,将扩增产物克隆入pMD18-T载体,经酶切鉴定筛选出阳性克隆,进行序列测定和分析。序列分析表明:所扩增的TK基因的核苷酸长度为552bp,,共编码183个氨基酸。同源性分析表明:经鹅胚驯化的FPVTK基因片段与已发表的282E4株FPVTK基因比较核苷酸序列同源性为99.82%,氨基酸序列同源性为99.45%。