猪生殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白在昆虫细胞中的表达及其用作诊断抗原的研究

对猪生殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）核衣壳蛋白（Ｎ）作为ＥＬＩＳＡ抗原进行了研究，将编码ＰＲＲＳＶＮ蛋白的基因０ＲＦ７ｃＤＮＡ插入杆状病毒表达载体ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２Ａ，通过同源重组获得了重组杆状病毒ＯＲＦ７－ＡｃＭＮＰＶ，感染昆虫细胞ＳＦ９表达了Ｎ蛋白，占细胞总蛋白的７．０７％，纯化后作为抗原建立了间接ＥＬＩＳＡ，与ＩＤＥＸＸ公司的ＥＬＩＳＡ诊断试剂盒有９６％的符合率，与ＩＦＡ有１００％的符合率。试验证实：ＰＲＲＳＶＮ蛋白在昆虫细胞中得到高效表达且是检测ＰＲＲＳＶ抗体的良好抗原。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒基质膜蛋白和核衣壳蛋白基因的克隆与鉴定

猪繁殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的基质膜（Ｍ）蛋白和核衣壳（Ｎ）蛋白是２种重要的结构蛋白。本试验根据ＰＲＲＳＶ美洲毒株的基因序列,设计了能够扩增Ｍ和Ｎ蛋白基因的１对引物,并在２个引物的两端分别加入ＥｃｏＲＩ和ＢａｍＨＩ酶切位点,经ＲＴ－ＰＣＲ技术获得了一约９５０ｂｐ的目的基因片段,并将此基因克隆于ＰＢＶ２２０载体,构建了ＭＮ蛋白基因重组质粒ＰＢＶＭＮ,进一步由重组质粒回收ＭＮ基因片段亚克隆于ｐＳＫ＋（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ＋）测序载体,构建了重组质粒ＰＢＳＭＮ,经部分序列分析鉴定,重组质粒含ＭＮ蛋白基因。此基因的克隆为进一步研究该病毒ＭＮ蛋白免疫学特性及其分子基础和基因诊断技术奠定了基础。     

应用杆状病毒系统高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒GPS基因

将猪繁殖与呼吸综合征症病毒ＣＨ－ａｌ株囊膜糖蛋白（ＧＰ５）一向克隆到杆状病毒转移载体ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ中,与太毒线性ＤＮＡ（Ｂａｃ－Ｎ－Ｂｌｕｅ＾ＴＭＤＮＡ）共转染昆虫细胞ｓｆ９,经过三轮蚀斑纯化后,获得重组杆状病毒ｒＢａｃ＝ＧＰ５。用该重组病毒感染ｓｆ９细胞后,应用间接免疫荧光试验、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ检测表明,ＧＰ５基因在杆癍病毒系统中获得了高效表达,表达产物因糖基     

应用重组N蛋白—ELISA检测猪繁殖与呼吸综合征抗体的研究

利用昆虫杆状病毒表达系统表达的猪繁殖与呼吸综合征重组N蛋白作为抗原，包被聚苯乙烯微量反应板，建立了猪繁殖与呼吸综合征重组N蛋白-ELISA诊断方法。试验证明，该方法对其他8种猪疫病阳性血清均无交叉反应，对标准阳性样品的检出率为100%。具有敏感性高、特异性强的特点。     

猪繁殖和呼吸综合征病毒膜蛋白和核衣壳蛋白基因序列分析

猪繁殖和呼吸综合征病毒弱毒疫苗株基质膜蛋白和核衣壳蛋白基因克隆于ｐＢＶ２２０载体，然后将ＭＮ基因亚克隆于ｐＳＫ（ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐＴⅡＳＫ＾＋）载体，构建成重组质粒ＰＢＳＭＮ进行序列测定，共测得９５８ｂｐ，Ｍ和Ｎ基因分别位于ＯＲＦ６和ＯＲＦ７。     

PRRS病毒核衣壳蛋白在大肠杆菌中的高效表达

用表达非融合蛋白的原核表达载体ｐＢＶ２２０,通过ＰＣＲ技术的引物设计对ＰＲＲＳ病毒ＢＪ－４株核衣壳蛋白（Ｎ）基因起始密码子上游进行了改造和修饰,在其上游加入了 ＥｃｏＲＩ酶切位点。将 ＰＲＲＳ病毒 Ｎ基因插入载体 ｐＢＶ２２０ ＰＬＰＲ启动子和Ｓ－Ｄ序列下游合适距离的位置,成功地构建了含有ＰＲＲＳ病毒Ｎ基因的原核重组表达载体ｐＢＶ－Ｎ。ｐＢＶ－Ｎ转化大肠杆菌ＤＨ５ａ,经温度诱导后菌体裂解物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析发现,在约１５ｋＤ处出现一条特异性的目的蛋白条带,分子量大小与ＰＲＲＳ病毒Ｎ蛋白相符,而诱…     

猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白基因的分离与分析

根据ＧｅｎＢａｎｋ中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）的核酸序列，设计合成１对引物，用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）从病毒猪肺中扩增出编码核衣壳蛋白（ＮＰ）基因，克隆入Ｔ－载体后，利用双脱氧链末端终止法测定序列，所获得的序列经Ｂａｎｋｉｔ投放到ＧｅｎＢａｎｋ，并利用ＤＮＡＳＩＳ、Ｄｎａｓｔａｒ等软件进行了分析。     

共表达PRRSV GP5和N蛋白重组杆状病毒的构建与鉴定

利用杆状病毒双表达系统构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（HP—PRRSV）N蛋白和GP5蛋白的重组杆状病毒Bac—N—GP5,对重组病毒进行间接免疫荧光、Westernblot分析以及动物免疫试验。结果表明：重组杆状病毒中表达了重组N和GP5蛋白,重组杆状病毒免疫小鼠后产生了抗PRRSVGP5蛋白和N蛋白的特异性抗体。本试验成功构建共表达PRRSVN蛋白和GP5蛋白的重组杆状病毒,为下一步应用该重组杆状病毒作为基因工程亚单位疫苗奠定基础。     

应用重组猪生殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白为抗原建立I—ELISA检？…

用重组杆状病毒表达的钎生殖和呼吸综合征病毒（ＰＲＲＳＶ）Ｎ蛋白作为抗原，建立了诊断猪生殖和呼吸综合征（ＰＲＲＳ）的Ｉ－ＥＬＩＳＡ，与ＩＤＥＸＸ公司试剂盒检测结果的符合率为９７．３％，与间接 光抗体试验９ＩＦＡ）的符合率为１００％。用该方法的检测国内猪血清８５份，阳性率为１８．８％；能检出ＰＲＲＳ疫苗免疫猪６ｄ的血清抗体，；与猪瘟、伪狂犬病、猪巴氏杆菌病、猪霉形体病阳性血清无交叉反应。     

流感病毒血凝素基因在昆虫细胞中的表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增了禽流感病毒Ａ／Ｇｏｏｓｅ／Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ／１／９６（Ｈ５Ｎ１）１．７ｋｂ的ＨＡ基因,将其克隆到ｐＵＣ１９的ＢａｍＨＩ位点,筛选到阳性重组子 ｐＵＣＨ５。然后将 ＨＡ基因亚克隆到杆状病毒转移载体 ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓＢ,筛选到重组转移载体ｐＢａｃＨ５。经过序列分析证明阅读框架正确后,在脂质体转染试剂介导下,ｐＢａｃＨ５与线性化的杆状病毒 ＤＮＡ（Ｂａｃ－Ｎ－Ｂｌｕｅ ＤＮＡ）共转染Ｓｆ９昆虫细胞。重组杆状病毒经三轮蚀斑纯化,获得纯化的重组杆状病毒ｒＢａｃＨ５。提取重组杆状病毒ＤＮＡ经ＰＣＲ扩增证明目的基因片段插入到杆状病毒基因组中。间接免疫荧光染色试验、血凝试验和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ试验结果表明 ＨＡ基因在重组杆状病毒感染的Ｓｆ９细胞表面获得表达。重组杆状病毒表达的ＨＡ蛋白能够凝集公鸡红细胞,血凝价１２８０－２５６０ＨＡＵ／ｍｌ。ＨＡ蛋白在杆状病毒表达系统的成功表达,为禽流感亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

猪圆环病毒重组Cap蛋白单克隆抗体的制备及初步应用

利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中表达PCV2-ORF2基因,并以构建的重组杆状病毒为免疫原,通过杂交瘤技术,研制针对PCV2的单克隆抗体,为建立准确快速的PCV2诊断方法奠定基础。首先将PCV2-ORF2基因克隆到杆状病毒的转移载体pFastBacTM1中,然后将其转化入大肠杆菌感受态细胞DH10Bac中,与DH10Bac中的穿梭载体Bacmid发生转座,通过抗性和蓝白斑筛选,得到重组杆状病毒质粒reBacmid-ORF2,通过脂质体介导reBacmid-ORF2转染Sf9细胞,成功获得了表达PCV2-ORF2基因的P1代重组杆状病毒。将所获得的重组杆状病毒经Vivaflow200浓缩后,免疫6~8周龄BALB/c小鼠,取其脾脏与Sp2/0细胞融合,以IFA进行筛选,经多次亚克隆后得到3株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞,分别命名为5H6、4E2和5F7。通过IFA、IPMA及Western-blot试验对3株单抗特异性进行分析鉴定。结果显示,3株单抗均能与PCV2-Cap蛋白产生特异性的反应,并利用流式细胞术初步建立了对PCV2毒株感染PK15细胞的检测方法,从而为快速检测PCV2病毒奠定了基础。     

H7亚型禽流感病毒HA基因在杆状病毒系统中的表达

利用PCR反应，以特异性引物扩增禽流感病毒去除信号肽的H7亚型HA密码子优化基因，克隆到杆状病毒转移载体pFastBac-HTB中，转座DH10感受态细胞，通过蓝白斑筛选、PCR鉴定获得阳性克隆，然后提取基因组Bacmid，转染Sf9昆虫细胞，得到含H7亚型流感病毒HA基因的重组杆状病毒opti-H7HA-Bac。重组杆状病毒接种Sf9昆虫细胞，待绝大部分细胞产生细胞病变后收获细胞，细胞裂解产物经血凝试验、SDS-PAGE及Western blot分析证实，密码子优化的H7HA基因在重组杆状病毒opti-H7HA-Bac感染Sf9细胞后获得高效表达，且具有良好的蛋白活性及特异免疫反应原性。     

表达H7亚型禽流感HA基因杆状病毒转移载体的构建及重组病毒的鉴定

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV/Restock/1/34(H7N1)1.7kbHA基因的cDNA克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后,亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis4.5,筛选到重组质粒命名为rpBacHisH7HA。测序正确后,在脂质体介导下,与线性化的杆状病毒DNA(Bac-N-BlueTMDNA)共转染Sf9昆虫细胞,挑取蓝色蚀斑,经三轮蚀斑纯化,获得数株重组杆状病毒rBacHisH7HA。提取重组病毒DNA经PCR证明目的基因片段已插入杆状病毒基因组。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)F基因在昆虫细胞中的分泌表达及免疫原性研究

试验旨在探索利用杆状病毒表达系统分泌表达小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV） F基因蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PPRV F基因克隆到已插入蜂毒信号肽（melittin）的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含F基因的重组杆状病毒DNA （F-Bacmid）,转染提取的F-Bacmid DNA至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒（F-rBac）,应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。SDS-PAGE结果表明,重组蛋白在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示,重组蛋白可被PPRV的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠试验结果显示,该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。本研究成功分泌表达了PPRV F蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为小反刍兽疫亚单位疫苗的研制奠定基础。     

Study on Secretory Expression and Immunogenicity of PPRV F Gene in Insect Cells

This study was aimed to explore the use of baculovirus expression system to secrete peste des petits ruminants virus (PPRV) F gene protein and use it as subunit vaccine. The gene fragment encoding F protein of PPRV was cloned into the baculovirus pFastBac Ⅰ transfer vector with a honeybee melittin signal peptide.The constructed F-pFastBac was transformed into Escherichia coli DH10Bac,resulting the recombinant baculovirus DNA (F-Bacmid) which was confirmed by blue-white plaque assay and antibiotic resistance selection.The F-Bacmid was then transfected into Sf9 insect cells by the cellfectin transfection reagent.The recombinant F protein was expressed in High Five cells in the serum-free medium.The SDS-PAGE and Western blotting analysis of recombinant protein showed that the protein could be expressed in insect cells and secreted into the culture medium. For the immunogenicity study,the recombinant protein was then inoculated into BALB/c mice, the results showed that the recombinant protein was able to stimulate B cells to produce special antibodies. In conclusions,the recombinant baculovirus expressing F protein of PPRV were successfully constructed.This study applied a basis for the development of PPRV subunit vaccine.     

禽流感病毒A/PFV/Restock/34(H7N1)HA基因在昆虫/杆状病毒系统中的表达

经RT-PCR扩增了禽流感病毒A/PFV／Restock／1／34（H7N1）1．7kbHA基因的cDNA，将其克隆到pMD18-T中并测序。在去除编码HA信号肽的核苷酸序列后，亚克隆到杆状病毒转移载体pBlueBacHis，筛选到重组质粒命名为pBlueBacHisH7HA，测序正确后与线性化的杆状病毒DNA（Bac-N-Blue^TMDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经三轮蚀斑纯化，获得数株重组杆状病毒rpBlueHisH7HA。提取重组病毒DNA，经PCR证明目的基因片段已插入到杆状病毒基因组中，血凝实验、SDS-PAGE和Western blot实验结果表明HA基因在重组杆状病毒感染的HFive细胞中获得了表达。     

Expression of Recombinant bovine L-selectin in Escherichia coli and insect cells.

Bovine L-selectin was expressed in bacteria using pGEX vector and in insect cells infected with recombinant baculovirus in order to obtain recombinant protein for preparation of specific antiserum and its functional studies. In bacterial expression, L-selectin fusion protein with glutathione S-transferase was detected in the insoluble fraction with the expected molecular weight of 60 kDa by SDS-PAGE and reacted with anti-bovine CD62L monoclonal antibody in immunoblot analysis. In insect cells infected with recombinant baculovirus, a band corresponding to L-selectin was not observed in SDS-PAGE with protein staining, but they apparently reacted with anti-bovine CD62L monoclonal antibody in immunoblot analysis. Furthermore, the indirect immunofluorescence test revealed that bovine L-selectin was efficiently expressed on the surface of Sf9 cells infected with recombinant baculovirus, and flow cytometric analysis showed that the percentage of CD62L positive cells in bovine PBMC was about 66% and that most Sf9 cells infected with recombinant baculovirus had specific immunofluorescence.     

H7亚型禽流感病毒HA1基因在重组杆状病毒中的表达及其表达产物的抗原性

从pMD18-T—HA阳性质粒中扩增出H7亚型禽流感病毒（AIV）HA1基因，并亚克隆至昆虫杆状病毒转移载体pBlueBacHis2A，将筛选的重组质粒命名为pBlueBacHisH7-HA1，与线性化杆状病毒DNA（Bac—N—BlueDNA）共转染sf9昆虫细胞，挑取蓝色蚀斑，经3次蚀斑纯化，得到重组杆状病毒rpBlue-HisH7HA1。Western-blotting和间接免疫荧光试验结果显示，HA1在昆虫细胞中得到表达，且表达产物具有抗原性。抗原特异性试验证明，重组HA1蛋白与鸡H5、H9亚型AIV抗血清不发生交叉反应。血凝试验证明，重组HA1蛋白具有良好的血凝性。     

猪瘟病毒E2(gp55)基因在昆虫细胞中的表达

将除去3'端跨膜区的猪瘟病毒E2基因亚克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,获得重组质粒pFBHT-E2,转化进含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,发生转座作用,经抗性及蓝白斑筛选得到含E2基因的重组载体质粒rBacmid-E2,以脂质体介导的方法将此重组载体质粒转染sf9昆虫细胞,获得重组病毒,命名为rvBac-E2.经SDS-PAGE和Western-blot及ELISA等方法检测,结果表明,此E2基因在昆虫细胞中正确表达,表达的蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应.