羊口疮病毒强弱毒株免疫相关基因的比较分析

通过对采集到的青岛市某发病羊场羊口疮病料（强毒）在山羊成纤维细胞上连续传90代（弱毒）后, 分别进行病毒基因组提取, 并对提取到的基因组分别命名为ORFV-QD和ORFV-RD。根据GenBank上发表的ORFV全基因组序列设计并合成3对特异性引物, 分别扩增ORFV-QD和ORFV-RD的B2L基因、F1L基因和VIR基因片段, 并将扩增得到的基因组片段分别克隆到pMD-19T载体上, 转化到DH5α感受态细胞中, 对重组质粒进行鉴定后送至测序公司进行测序, 用DNASTAR软件对测序结果进行拼接及3组基因之间核苷酸同源性比较分析, 将测序结果与NCBI上已公布的13组ORFV全基因组相应基因核苷酸序列进行同源性比对分析、构建系统进化树及氨基酸序列比对分析。结果表明, 3组基因与参考序列的B2L基因、F1L基因和VIR基因核苷酸同源性分别为92.1%~98.4%、96.1%~99.1%和94.6%~100%。将2株病毒基因组与参考序列进行氨基酸序列比较分析, 结果显示2株病毒基因组之间并没有较为明显的差异。     

江苏省羊口疮病毒的分离鉴定及B2L基因的遗传进化分析

为了解江苏省近年来羊口疮病毒（Orf virus,ORFV）的流行情况,更好地控制江苏地区的羊口疮病,2013~2015年采集江苏部分地区羊口疮疑似病料121份,进行病毒分离鉴定及其B2L基因的遗传进化分析。结果显示,样品中ORFV PCR检测阳性4份,用胎羊鼻甲骨细胞（OFTu）和MDBK细胞进行病毒分离,分离到4株病毒。这4株病毒分别命名为ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China、ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China、ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China和ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China。扩增ORFV的B2L基因全长并绘制遗传进化树。B2L基因序列分析显示,4株分离株之间的核酸同源性为98.5%~100.0%。遗传进化树显示,ORFV/Ovis/XZ/Jiangsu/2015/China株、ORFV1/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China株和ORFV2/Ovis/DT/Jiangsu/2015/China株与SC-JY、GX-YB、JS-FX株聚成一簇,核苷酸同源性为97.8%~100.0%。ORFV/Ovis/SL/Jiangsu/2015/China与LiaoNing、HuB、Gansu株亲缘关系接近,核苷酸同源性为98.8%~98.9%。4株分离株与中国疫苗株的核苷酸同源性为96.8%~98.1%。结果表明,江苏地区的ORFV来源可能不同,有必要开展更为深入的流行病学调查,为防控江苏地区的羊口疮奠定基础。     

羊传染性脓疱病毒松原分离株的分离鉴定及B2L基因的克隆与序列分析

利用原代犊牛睾丸细胞从临床上表现口疮症状的羔羊痂皮材料中分离获得1株病毒,对该株病毒进行病毒形态学、理化学、PCR检测与动物回归试验等系统鉴定后,证实该分离株为羊传染性脓疱病毒(Orf virus,ORFV),命名为()RFV-sy.利用PCR方法克隆出其B2L基因,并将该基因序列和推导的氨基酸序列与6个不同来源的ORFV毒株进行同源性和亲缘关系的比较分析.结果表明,各毒株间核苷酸和氨基酸的同源性分别为97.8%～99.5%和97.6%～99.5%;系统发育进化树结果表明,ORFV-sy毒株与印度分离绵羊株ORFV-Mukteswar 67/04、ORFV-Izatnagar 79/04的亲缘关系较近,表明不同地区分离毒株的B2L基因差异不大.     

羊口疮病毒大足株的分离鉴定

本研究旨在了解重庆地区羊口疮病毒（orf virus，ORFV）流行情况。从重庆大足等地区羊场采集18份临床疑似羊口疮病料，提取病料DNA，经PCR鉴定为ORFV阳性；将阳性病料做常规处理，接种羔羊睾丸细胞（LT），并盲传至5代，观察接毒LT细胞病变，将F5代细胞培养物进行间接免疫荧光试验（IFA）、PCR扩增、测序、同源性比对、遗传进化分析和TCID₅₀测定。结果显示，经PCR检测，18份疑似羊口疮病料ORFV核酸阳性率为61.1%（11/18）；大足株病料接种LT细胞36 h后，长梭型细胞变圆、融合、呈拉网状、皱缩，72 h后大部分细胞脱落；间接免疫荧光试验在显微镜下观察到细胞浆中出现特异性绿色荧光，且荧光绕核分布；F1至F5代细胞培养物经PCR扩增出特异性目的条带，大小为1 137 bp；将测序结果与GenBank中19株ORFV B2L基因进行同源性比对，其核苷酸同源性在97.9%~100%之间，与美国SA00分离株同源性达100%，且遗传进化分析显示处于同一进化分支，亲缘关系较近；测定F5代细胞培养物TCID₅₀值为10^-5.68/0.1 mL，在细胞中能稳定增殖。综上所述，本研究成功分离并获得1株ORFV，为后续ORFV研究提供了生物材料，同时为防控重庆地区的羊口疮奠定基础。     

羊口疮病毒的分离与鉴定

本试验利用犊牛睾丸细胞、羔羊睾丸细胞、MDBK、BHK-21细胞对采自内蒙古赤峰的疑似羊口疮发病羊群的唇部痂皮组织进行接种传代,分离出1株病毒,通过透射电镜负染观察和PCR检测对该分离株进行鉴定。参照GenBank中羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORF059 (F1L)基因的核苷酸序列,设计并合成1对特异性引物,成功地对分离株的F1L基因进行克隆、测序,并与多株参考毒株进行了同源性比对分析,结果显示经透射电镜负染观察到典型的副痘病毒粒子,与参考毒株序列相比均具有较高的同源性,均为96%以上,结果表明该分离株为ORFV,命名为OV/nm-hd。     

新疆羊口疮病毒分离鉴定及B2L基因分析与表达

为研究新疆地区羊口疮(Orf)病毒(ORFV)的生物学特性及流行特征,本研究采集新疆地区疑似Orf的羔羊结痂病料,用MDBK传代细胞进行病毒分离培养及电镜观察,进行动物回归实验;对ORFV B2L基因进行PCR扩增,并构建B2L基因原核表达重组质粒pET-32a-B2L,转化至大肠杆菌BL21.将表达产物进行SDS-PAGE及western blot检测,结果证明所获得的分离株ORFV-shz为ORFV,与India 67/04分离株的亲缘关系最近,其重组B2L蛋白大小为60 ku,并具有良好反应原性.     

湖北省羊口疮病毒的分离鉴定

利用MDBK传代细胞系对湖北通山县某羊场疑似羊口疮(Orf)的黑山羊病料进行分离,通过病毒理化特性试验、动物回归试验和PCR等方法对分离的毒株进行鉴定。结果表明,病料悬液接种MDBK细胞后出现细胞病变,接种病料的羊只出现典型的Orf症状,扩增出羊口疮病毒(Orf virus)B2L基因,该毒株与台湾山羊株(EU935106.1、DQ904351.1)相似性最高(均为99%),亲缘关系最近。本研究成功分离鉴定到一株ORFV,命名为ORFV/HB/09。     

羊口疮病毒大足株的分离鉴定

本研究旨在了解重庆地区羊口疮病毒(orf virus,ORFV)流行情况。从重庆大足等地区羊场采集18份临床疑似羊口疮病料,提取病料DNA,经PCR鉴定为ORFV阳性;将阳性病料做常规处理,接种羔羊睾丸细胞(LT),并盲传至5代,观察接毒LT细胞病变,将F5代细胞培养物进行间接免疫荧光试验(IFA)、PCR扩增、测序、同源性比对、遗传进化分析和TCID_(50)测定。结果显示,经PCR检测,18份疑似羊口疮病料ORFV核酸阳性率为61.1%(11/18);大足株病料接种LT细胞36 h后,长梭型细胞变圆、融合、呈拉网状、皱缩,72 h后大部分细胞脱落;间接免疫荧光试验在显微镜下观察到细胞浆中出现特异性绿色荧光,且荧光绕核分布;F1至F5代细胞培养物经PCR扩增出特异性目的条带,大小为1 137 bp;将测序结果与GenBank中19株ORFV B2L基因进行同源性比对,其核苷酸同源性在97.9%～100%之间,与美国SA00分离株同源性达100%,且遗传进化分析显示处于同一进化分支,亲缘关系较近;测定F5代细胞培养物TCID_(50)值为10~(-5.68)/0.1 mL,在细胞中能稳定增殖。综上所述,本研究成功分离并获得1株ORFV,为后续ORFV研究提供了生物材料,同时为防控重庆地区的羊口疮奠定基础。     

羊口疮病毒农安分离株的分离鉴定及Orf059(F1L)基因的序列分析

利用初生胎羊鼻甲骨(Primary ovine fetal turbinate,OFTu)细胞从送检的疑似“口疮”症状的病羊唇部痂皮中分离获得1株病毒,用PCR检测、电镜负染观察及理化性质测定等方法对该分离株病毒进行鉴定,证实该分离株为羊传染性脓疱病毒(Off virus,ORFV),命名为(Orf virus Jilin-Nongan,ORFV JL-NA株).对ORFV JL-NA分离株Orf059(F1L)基因进行克隆、测序并对测序结果进行序列分析.结果显示,获得的ORFV JL-NA分离株Orf059(F1L)基因序列长为994 bp,编码329个氨基酸,与ORFV-D1701株、ORFV-Jilin株、ORFV-NZ2株、ORFV-20株、ORFV-7株、ORFV-C2株、ORFV-IA82株、ORFV-SA00株、ORFV-mi90株、ORFV-torino株、ORFV-Shanxi株核苷酸序列同源性分别为96.4％、97.3％、99.1％、98.7％、99.0％、97.5％、98.4％、97.2％、97.4％、96.9％和96.8％.遗传进化树结果显示,ORFV JL-NA分离株与意大利ORFV-7毒株的亲缘关系较近,表明不同地区分离株的Orf059(F1L)基因差异不大.     

羊口疮病毒的分离鉴定及F1L基因的遗传变异分析

采用羊胚胎鼻甲(OFTu)细胞对湖北某山羊养殖场疑似羊口疮(Orf)的病羊唇部痂皮组织进行病毒分离,通过病理组织学、电镜形态观察及PCR试验等方法对分离的病毒进行鉴定,证实分离毒株为羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),命名为HuB13。分析HuB13 F1L基因序列,结果F1L基因全长为1 017 bp,编码339个氨基酸,G+C含量为64.70%。遗传进化树显示,HuB13与8株山羊和6株绵羊来源的ORFV同源性分别为97.50%～99.41%和97.15%～97.35%,与牛痘病毒(PCPV)和牛丘疹性皮炎病毒(BPSV)同源性分别为88.0%～88.69%和75.15%。Bioedit软件分析发现宿主为山羊和绵羊的ORFV存在1个高变异区(148～171 bp)和6个特异性位点G186C、T187G、A541G、A765G、G856A和G982A。研究结果为开发宿主特异的Orf疫苗及致病机理研究提供参考依据。     

绵羊不同妊娠时期卵巢转录组差异表达比较分析

[目的]探究随着绵羊体内胎儿的发育,母体卵巢转录组表达水平的变化。[方法]试验绵羊为苏格兰黑面羊和特克赛尔羊F₁代杂交品种,3个妊娠时间分别为妊娠23 d、妊娠35 d和妊娠100 d。从NCBI的高通量测序数据SRA存储库下载3个妊娠时期绵羊卵巢转录组的18个样本数据。使用Z-Score方法对转录组数据进行标准化处理。将妊娠23 d、妊娠35 d的绵羊卵巢组织进行比对,妊娠35 d、妊娠100 d的绵羊卵巢组织进行比对,使用R语言的limma包进行基因差异表达分析,筛选DEGs,以P-Value<0.05和|logFC|≥2作为筛选DEGs条件。利用DAVID在线软件对DEGs进行注释及功能富集分析,并以P-Value<0.05作为信号通路显著富集标志。[结果]在妊娠23 d与妊娠35 d组绵羊卵巢中筛选出54个DEGs,妊娠35 d与妊娠100 d组绵羊卵巢中筛选出68个DEGs,两组均包含HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2和HSP90B1基因。妊娠23 d与35 d组绵羊卵巢的54个DEGs显著富集到包括内质网蛋白质加工信号通路、核糖体信号通路、雌激素信号通路、癌症蛋白聚糖信号通路、扩张型心肌病信号通路、肥厚型心肌病信号通路6条通路;妊娠35 d、妊娠100 d组绵羊卵巢的68个DEGs显著富集到包括癌症相关信号通路、黏着斑信号通路、抗原加工与提呈信号通路、细胞外基质受体相互作用信号通路、细菌侵袭上皮细胞信号通路、内质网蛋白质加工信号通路、核糖体信号通路、雌激素信号通路、PI3K-Akt信号通路、癌症蛋白聚糖信号通路和前列腺癌信号通路11条通路。[结论]在妊娠期间雌激素信号通路上的HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2和HSP90B1基因表达有很大变化,这些基因可能对绵羊妊娠维持有着重要的作用。     

羊传染性脓疱病毒疫苗株和野毒株GIF基因比较分析

羊传染性脓疱(orf)是由羊传染性脓疱病毒(orf virus,ORFV)感染引起的绵羊和山羊的一种接触性人兽共患病。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)/白细胞介素(IL-2)抑制因子(GIF)基因为ORFV编码中晚期病毒基因,它能够与GM-CSF、IL-2结合并且抑制二者的活性,从而抑制宿主抗病毒作用。为了比较疫苗毒株和流行毒株间GIF的差异,本试验扩增并测定了ORFV疫苗株和野毒株的GIF基因序列,比较分析了ORFV疫苗弱毒株和野毒株GIF基因的核酸水平和氨基酸水平的差异情况,以及二、三级蛋白结构。结果表明:本次测定的ORFV疫苗株与野毒GIF基因核苷酸序列相似性为94.3%,氨基酸序列相似性为92.5%,两者的蛋白三级结构预测上也有差异。本研究结果为该病的防控提供了参考依据。     

贵州省羊口疮病例分子生物学诊断

为了更好地鉴别诊断疑似羊口疮病例,采用PCR技术、分子克隆技术和生物信息技术对毕节地区羊口疮疑似病例进行实验室诊断。结果显示,从疑似病例组织病料中扩增出与预期大小相符的1137bp的B2L基因片断,且该基因核苷酸同源性与GenBank中已发表羊口疮病毒序列间的同源性为97．1％～99．1％。试验结果表明,该病例为羊口疮...     

Suppression of influenza virus infection by the orf virus isolated in Taiwan

Orf virus (ORFV), a member of parapoxvirus, is an enveloped virus with genome of double-stranded DNA. ORFV causes contagious pustular dermatitis or contagious ecthyma in sheep and goats worldwide. In general, detection of viral DNA and observing ORFV virion in tissues of afflicted animals are two methods commonly used for diagnosis of orf infection; however, isolation of the ORFV in cell culture using virus-containing tissue as inoculum is known to be difficult. In this work, the ORFV (Hoping strain) isolated in central Taiwan was successfully grown in cell culture. We further examined the biochemical characteristic of our isolate, including viral genotyping, viral mRNA and protein expression. By electron microscopy, one unique form of viral particle from ORFV infected cellular lysate was demonstrated in the negative-stained field. Moreover, immunomodulating and anti-influenza virus properties of this ORFV were investigated. ORFV stimulated human monocytes (THP-1) secreting proinflammatory cytokines IL-8 and TNF-α. And, pre-treatment of ORFV-infected cell medium prevents A549 cells from subsequent type A influenza virus (IAV) infection. Similarly, mice infected with ORFV via both intramuscular and subcutaneous routes at two days prior to IAV infection significantly decreased the replication of IAV. In summary, the results of a current study indicated our Hoping strain harbors the immune modulator property; with such a bio-adjuvanticity, we further proved that pre-exposure of ORFV protects animals from subsequent IAV infection.     

动物组织中GLUD1基因表达与GDH蛋白结构分析

[目的]研究动物不同组织中GLUD1基因的表达情况,比较不同物种中GDH蛋白的结构差异,明晰GLUD1基因的表达模式与GDH蛋白的功能。[方法]分别采集大鼠、绵羊、梅花鹿的肝脏、肾脏、皮肤、脂肪和肌肉5种新鲜组织样品。以β-actin为内参基因,采用荧光定量PCR法（qRT-PCR）分析3种动物不同组织中GLUD1基因的表达情况;利用无重复双因素分析方法表征GLUD1基因在不同组织中的表达量差异。比较人、小鼠、大鼠、山羊、绵羊、牛和猪7个物种GDH蛋白氨基酸序列,模拟这7个物种的GDH蛋白三维空间结构。[结果]GLUD1基因在大鼠、绵羊和梅花鹿的5个组织中均有表达,在肝脏中的表达量均高于其他组织;该基因在大鼠和梅花鹿肝脏组织中的表达量极显著（P<0.01）高于绵羊肝脏组织中的表达量,在大鼠肾脏组织中的表达量极显著（P<0.01）高于梅花鹿肾脏组织中的表达量。人GDH蛋白的氨基酸序列与猪、牛、山羊和绵羊的序列相似度较高,而大鼠与小鼠GDH蛋白的氨基酸序列相似度达到99.10%。大鼠、人、猪的GDH蛋白氨基酸序列中分别存在2个（第8位丙氨酸→缬氨酸、第40位丙氨酸→缬氨酸）、1个（第23位丙氨酸→丝氨酸）、2个（第33位丙氨酸→苏氨酸、第39位丙氨酸→苏氨酸）物种特异性突变位点。小鼠、大鼠、人的GDH蛋白预测为三聚体结构,山羊、绵羊、牛和猪的GDH蛋白预测为同源六聚体结构。[结论]GLUD1基因在大鼠、绵羊、梅花鹿不同组织中的表达量存在差异,在肝脏中都有较高水平的表达。不同物种GDH蛋白的氨基酸序列相似度较高,但依旧存在一定的序列差异性,并且存在数个对应物种特异性的氨基酸突变位点。     

1株鸡源奇异变形杆菌的分离鉴定及药敏试验

[目的] 阐明青海省大通县某鸡场病鸡发病原因,为奇异变形杆菌病防控提供参考。[方法] 无菌采集病鸡肝脏、脾脏和泄殖腔拭子等样品,接种普通琼脂和SS琼脂平板进行细菌分离纯化培养,挑取平板上生长的疑似菌落进行革兰染色镜检,再将分离的菌落接种生化鉴定管进行生化鉴定,同时通过PCR扩增16S rDNA和tuf特异性基因并测序。将分离菌接种雏鸡进行致病性试验,采用K-B法评价分离菌对27种抗菌药物的敏感性。[结果] 分离菌为短杆、长杆状多形性杆菌,生化特性与奇异变形杆菌相符。PCR成功扩增出1 400 bp的16S rDNA,序列比对显示与奇异变形杆菌同源性最高,为99.9%。雏鸡致病性试验结果表明,该株奇异变形杆菌对雏鸡有致病性。药敏试验结果显示,该菌株对哌拉西林、头孢吡肟和头孢噻肟等高度敏感,对环丙沙星、奥格门汀中度敏感,对氨苄西林、阿莫西林和头孢唑啉有耐药性,提示该菌对头孢类药物高度敏感。[结论] 分离到的一株奇异变形杆菌对鸡具有较强的致病性,且对多种药物表现出耐药性。     

Comparative sequence analysis of poxvirus A32 gene encoded ATPase protein and carboxyl terminal heterogeneity of Indian orf viruses

Thirteen orf virus (ORFV) isolates from natural outbreaks in sheep and goats belonging to different geographical regions of India were analysed on the basis of ORF108 (a homologue of poxviral A32 gene), which is known to encode for ATPase and involved in virion DNA packaging. Comparative sequence analysis of ATPase proteins revealed highly conserved N-terminal region with five different motifs [Walker A, Walker B, A32L specific motifs (III and IV) and a novel AYDG (motif-V)] among all poxviruses and divergent carboxyl terminus with either single or double RGD sequences among all Indian ORFV isolates. A homology model and secondary structure predictions of N-terminal region of ORFV A32 revealed that most of the poxviruses including ORFV ATPase protein belong to a distinct clade of the HerA/FtsK super family of DNA packaging proteins. Despite differences in host cell specificity and poxvirus infections among animals, DNA packaging motor domain of poxviruses presumed to share remarkable similarities as indicated by the presence of conserved ATPase motifs in the present investigation. The study also indicated the circulation of heterogeneous strains of ORFV in India and possibilities of differentiation of ORFV strains based on C-terminal heterogeneity.     

规模化驴场中马流感病毒H3N8亚型感染情况调查

[目的]调查山东省聊城市规模化驴场中马流感病毒的感染情况,并分析其可能的来源。[方法]从聊城的规模化驴场采集病料和血清,通过HI试验检测驴血清中的马流感病毒H3N8亚型抗体的阳性率。使用RT-PCR技术扩增肺脏和鼻腔棉拭子样品中的马流感病毒M基因,对获得的马流感病毒M基因与不同流感病毒的M基因进行序列比对,推测其来源。[结果]HI试验表明,120个血清样品中马流感病毒H3N8亚型血清抗体阳性率为33.3%(40/120);其中,母驴的马流感病毒H3N8亚型血清抗体阳性率为42.5%(17/40)、公驴为32.5%(13/40)、驴驹为25.0%(10/40)。通过RT-PCR检测发现,32.3%(21/65)的样品可测出目的条带。通过序列比对得出,该试验获得的流感病毒M基因与马属动物的H3N8亚型流感病毒高度同源(CY032222、CY032318、CY028821等),同源性最高可达99.8%。[结论]马流感病毒在聊城周边的数个规模化养驴场发生流行。该研究从驴体内分离的流感病毒M基因属于马流感病毒H3N8亚型M基因。