口蹄疫病毒O／China／99株VP1基因植物种子特异性表达载体的构建及农杆菌的导入

根据植物组成型表达质粒pBin438的限制性酶切位点及FMDV VP1的核苷酸序列设计并合成引物，从种子特异性启动子7S质粒pU8—2质粒中扩增7S启动子，经HindⅢ和BarnHⅠ酶切，与经同样双酶切的植物组成型表达载体pBin438大片段连接，经酶切、PCR鉴定及序列分析，种子特异性表达载体p7SBin438构建完成。从FMDV VP1基因的pGEM—VP1质粒中扩增VP1基因，经BarnHⅠ和SalⅠ双酶切后，与p7SBin438质粒酶切后的大片段连接，经酶切、PCR及测序鉴定，FMDV VP1基因已置于种子特异性启动子7S下游，成功构建了FMDV VP1基因的种子特异性表达载体p7SBin438-VP1。通过三亲交配法，将表达载体p7SBin438-VP1导入根癌农杆菌，为研究FMD可饲疫苗奠定了基础。     

绵羊itgαv基因靶向RNAi表达载体的构建和筛选

为了探讨和分析整联蛋白αv亚基基因(integrin alpha v,itgαv基因)的功能及受体基因表达量下调对口蹄疫病毒复制的影响,试验构建并筛选了绵羊itgαv基因的RNAi载体,根据绵羊itgαv基因核苷酸序列,设计了3条特异性双链小干扰RNA(short interfering RNA,siRNA)分子,将合成的DNA片段退火形成双链后,连接到p Genesil-1.3载体人源U6启动子下游,分别命名为Genesil-αv1、Genesil-αv2、Genesil-αv3;以乳腺组织RNA反转录产物为模板,扩增绵羊itgαv,并将其克隆入p EGFP-N1载体多克隆位点,构建itgαv与GFP蛋白融合表达载体p EGFP-itgαv,用上述Genesil-αv1、Genesil-αv2、Genesil-αv3载体分别与p EGFP-itgαv共转染豚鼠BHK-21细胞之后,通过绿色荧光信号观察和半定量RT-PCR检测siRNA分子对itgαv基因表达的抑制效果,经酶切及测序鉴定以及瞬转试验证实,载体表达的RNAi分子构建成功,且能有效抑制目标基因的体外表达。结果表明:研究成功构建了有效抑制itgαv基因表达的RNAi载体。     

牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因（Follistatin,FSTN）基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结...     

牛c-Myc/TAT/9R融合表达载体构建及其原核表达研究

原癌基因c-Myc虽然在许多肿瘤组织中特异性高表达,但它也是机体正常细胞生长与增殖所必需的因子,然而目前家畜诱导多潜能干细胞（iPS）研究中关于多功能转录因子c-Myc的报道很少.为此,研究拟利用蛋白转导区域（PTD）的跨膜作用,构建TAT-bc-Myc-9R融合表达载体,并对其进行原核表达,旨在为转录因子蛋白重编程牛体细胞奠定基础.试验以牛c-Myc基因编码区序列为参考,设计并合成含酶切位点、跨膜转导肽TAT和9R的引物,利用PCR等基因工程方法获得包括牛c-Myc、TAT和9R的重组原核表达载体（pTAT-HA-bc-Myc-9R）;酶切鉴定和DNA测序结果表明,试验成功获得bc-Myc-9R重组序列,成功构建重组质粒pTAT-bc-Myc-9R;不同IPTG浓度和诱导时间条件对该重组载体的诱导表达和SDS-PAGE分析表明,TAT-bc-Myc-9R在0.6 mmol/L IPTG和37℃诱导6h条件下表达约57KDa的目的蛋白.这些结果为PTD介导的转录因子蛋白直接重编程牛体细胞以获得iPS研究积累了科学资料.     

广西巴马小型猪Oct4基因克隆及其在成纤维细胞中的表达

根据GenBank中公布的猪Oct4核苷酸序列设计合成1对引物,采用RT-PCR方法从巴马小型猪睾丸组织扩增Oct4基因编码全序列。然后将该基因重组于含有绿色荧光报告基因的真核表达载体pEGFP-N1中,构建成pEGFP-Oct4重组质粒,通过酶切电泳鉴定和DNA测序证明重组质粒构建成功。使用脂质体2000将pEGFP-Oct4转染巴马小型猪肾脏成纤维细胞,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染细胞株中可检测到Oct4的转录。结果表明,成功构建了真核表达载体pEGFP-Oct4,并可在巴马小型猪肾脏成纤维细胞中表达,为进一步研究Oct4基因生物学功能奠定了基础。     

新城疫病毒F48E9株病毒F基因表达盒的火鸡疱疹病毒转移质粒载体构建

将新城疫病毒（NDV）F48E9株融合蛋白（F）基因1700bp克隆到真核表达载体pcDNA3中，构建成表达F基因的载体pc3F。然后将包含F基因及其上游的细胞巨化病毒启动子和增强子的3800bp DNA片段再克隆入包含火鸡疱疹病毒（HVT）非必须片段载体pTK2B中，构建成功含有F基因表达盒的HVT转移质粒体pTK3F。经限制性内切酶酶切分析，F基因表达盒的插入方向与pTK2B中TK基因转录方向一致。该研究为进一步在细胞中转染并获得表达F基因的HVT重组病毒奠定了基础。     

可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体的构建与鉴定

为了构建可定点整合的无筛选标记的拟蛛丝蛋白基因表达载体,试验以p EGFP-N1为骨架载体,并采用PCR技术分别添加Loxp和att B片段,利用无缝克隆法将拟蛛丝蛋白基因(2s)连入质粒,经过转化、阳性克隆筛选、酶切及DNA测序鉴定。结果表明:PCR产物及酶切片段大小符合预期结果,测序结果与相应寡核苷酸序列一致。说明试验成功构建了可定点整合的无筛选标记拟蛛丝蛋白基因表达载体p EGFP-N1-2s,可用于无筛选标记的转基因供体细胞的构建。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。     

猪防御素PBD-1基因的克隆及其表达载体构建

将猪防御素基因PBD-1分成5段人工合成,然后再通过PCR方法将这5小段延伸成完整的PBD-1基因序列,并使其两端在合成后分别带上酶切位点和保护碱基.将该基因定向插入带有相同酶切位点的真核表达质粒pcDNA3.1( )的多克隆位点上构建表达质粒.重组质粒经双酶切电泳分析、序列鉴定,表明PBD-1基因表达载体构建成功,为进一步研究PBD-1基因表达产物的抗菌活性及其抗菌机理打下基础.     

猪肌生成抑制素基因成熟蛋白编码序列表达载体的构建及其转录水平的检测

构建猪肌生成抑制素(MSTN)成熟蛋白编码序列的克隆与表达载体，并对mRNA进行转录水平的检测，为获得较好的猪肌生成抑制素抗原、制备抗体打下良好的基础。猪MSTN基因的cDNA去除信号肽后，用PCR扩增的1．2kb目的片段与pMDl8-T载体连接，将克隆载体的质粒DNA与同样用BamH Ⅰ和Sal Ⅰ限制性内切酶酶解的表达载体pET28a( )质粒定向连接，对筛选出的阳性克隆用酶切及测序法鉴定。对猪MSTN基因成熟蛋白编码序列进行反转录，对mRNA Northern杂交进行转录水平的检测。结果，所得到的序列与所设计的序列完全一致，表明成功地进行了猪MSTN基因编码序列的克隆及筛选；目的片段定向插入，阅读框架正确；RT-PCR成功地反转录得到约1．2kb的目的DNA片段，Northern杂交后对mRNA印迹放射自显影，见到清晰的1．2kb特异带。     

可定点整合的无筛选标记LacS基因表达载体的构建与鉴定

试验旨在构建一个能够定点整合且无筛选标记基因的半乳糖苷酶基因LacS表达载体.本研究以pEGFP-N1质粒为原始框架,通过PCR及限制性酶切位点在pEGFP-N1质粒的标记基因两端添加两个同向LoxP序列,在多克隆位点上游添加能够定点整合的attB序列,最后再将目的基因BC promoter-LacS-PolyA通过限制性酶切位点插入多克隆位点.每一步都进行PCR、酶切及测序鉴定.PCR产物及酶切片段大小符合预期结果,测序结果也与相应寡核苷酸序列一致,证明各个基因片段正确地连接到载体相应位置.本试验成功构建了可定点整合的无筛选标记半乳糖苷酶基因表达载体pEGFP-N1-LacS.     

四环素诱导的猪黑素皮质激素受体-4基因真核表达载体的构建

猪黑素皮质激素受体-4(melanocortin-4 receptor,MC4R)基因是影响猪生长肥育的主效基因之一,为了进一步研究MC4R基因的生物学功能,制备高成活率转基因猪,通过采用条件性诱导表达载体系统,PCR方法扩增了猪MC4R基因完整编码区,四环素诱导表达系统(Tet-on)的启动子调控区与转录调节元件。采用双酶切和连接等方法将上述元件连接到pcDNA3.1(+)上,构建了重组质粒pcDNA3.1(+)-rtTA-P_Tight-MC4R。经双酶切和测序鉴定,结果显示片段正向连接且片段全长测序正确。试验成功构建了四环素诱导的pcDNA3.1(+)-rtTA-P_Tight-MC4R真核表达载体, 并能在时间特异性方面调控MC4R基因的表达。     

猪肌肉生长抑制素基因启动子的克隆与鉴定

利用PCR方法从猪基因组DNA中扩增了1.2 kb的肌肉生长抑制素(myostatin)基因启动子序列。并进一步以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,构建了真核表达载体MSTNPro-EGFP;通过转染C2C12小鼠骨骼肌成肌细胞和猪成纤维细胞,对猪myostatin基因启动子的转录调控活性进行鉴定。结果表明:猪myostatin基因启动子可以启动GFP在C2C12细胞中的转录和表达,而将猪MSTNPro-EGFP载体转染猪胎儿成纤维细胞后并未观察到GFP的表达,说明myostatin基因表达的肌肉特异性源于启动子的转录特异性。     

广西巴马小型猪TXNIP基因真核表达载体的构建及鉴定

为了克隆广西巴马小型猪硫氧还蛋白相互作用蛋白基因(TXNIP)序列并构建真核表达载体,为生产转TXNIP基因的广西巴马小型猪奠定基础,试验采用RT-PCR技术从广西巴马小型猪胰腺组织中扩增出TXNIP基因编码序列,连接至p MD18-T载体,测序鉴定后提取质粒,用SalⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶进行双酶切,回收的TXNIP片段连接至p EGFP-C1载体上,构建含TXNIP的真核表达载体p EGFP-C1-TXNIP;利用双酶切和测序对重组质粒p EGFP-C1-TXNIP进行鉴定,并将重组质粒转染β-TC6细胞24 h后观察细胞荧光表达情况。结果表明:广西巴马小型猪TXNIP基因编码区序列长1 176 bp,编码391个氨基酸,与Gen Bank已公布的猪TXNIP基因c DNA序列(序列号为DQ278874)对应区段同源性为99.7%;重组表达载体p EGFP-C1-TXNIP质粒转染β-TC6细胞能表现出绿色荧光。     

生长抑素基因靶向siRNA表达载体的构建及对生长抑素基因表达的抑制作用

合成含靶向生长抑素（Somatostatin,SS）前体基因的siRNA转录模板的发夹结构,插入pSilencerTM2.1-U6载体构建重组质粒2.1-S。提取小鼠下丘脑组织总RNA,PCR扩增获得SS前体基因cDNA,构建真核表达载体pcDNA3.1-SS、pEGFP-SS。将2.1-S分别与pcDNA3.1-SS、pEGFP-SS共转染入细胞中瞬时表达,检测SS前体基因表达变化。结果显示,重组质粒在E.coli（DH5α）内扩增,酶切及测序鉴定证明siRNA转录模板完整,正确地插入到pSilencerTM2.1-U6质粒中,重组质粒pcDNA3.1-SS与pEGFP-SS经测序序列完全正确。转染细胞在mRNA水平及蛋白水平均检测到2.1-S对SS前体基因表达的抑制。这表明,SS基因靶向siRNA稳定表达载体能在哺乳动物细胞中表达,并对靶基因呈抑制作用。     

siat7e基因和st3gal I基因双表达载体的构建及其初步应用

应用聚合酶链式反应（PCR）技术,从人类基因组中扩增出全长为1011bp的唾液酸转移酶（siat7e基因）,并从鸡基因组中扩增出全长为1029bp的β-半乳糖苷α-2,3-唾液酸转移酶I（ST3GALI）基因。将它们分别克隆入pMDl8一T载体中。对扩增的全长siat7e基因序列采用BamHI和Pst I双酶切后连接入pReceiver真核表达载体,构建pRE—SIAT重组表达载体,进而,对扩增的全长st3galI基因采用SacI和劢0I双酶切,后连接入pRE—SIAT重组表达载体,构建pRE—SIAT—ST3重组真核表达载体。经限制性内切酶消化及DNA序列分析,证实构建的重组表达质粒是正确的。将构建的双基因表达载体转染MOCK细胞,利用荧光显微镜观察,可见细胞表达明显的绿色荧光,从而初步证实了外源基因在MDCK细胞中的正确表达。本研究为最终构建能够适应悬浮培养,并且对禽流感病毒更为易感的MDCK细胞系奠定了基础。     

哈萨克羊抑制素α基因原核表达载体的构建及其诱导表达

本实验以新疆哈萨克羊睾丸组织为实验材料,提取组织总RNA,经反转录得到c DNA并以此为模板,用以Gen Bank(NM_001308579.1)序列为参考设计的特异性引物进行PCR扩增,之后将扩增产物与p ET32a(+)载体相连,构建重组质粒p ET32a(+)-INHα。将构建好的重组质粒转化到受体菌E.coli BL21中,经IPTG诱导,表达p ET32a(+)-INHα重组蛋白。对扩增产物的测序鉴定结果显示INHα基因克隆成功;经过酶切和测序鉴定确定准确构建了p ET32a(+)-INHα重组载体;经Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定,检测到INHα基因编码区全序列表达的重组蛋白单一条带,这说明原核表达载体构建成功并在原核细胞中正常表达,这为今后绵羊INHα基因的免疫功能研究提供了参考依据。     

新孢子虫SAG1-SRS2融合基因真核表达质粒的构建及表达

根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSAG1-NcSRS2融合基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSAG1-SRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到COS-7细胞中进行瞬时表达,经免疫荧光检测,证实了该载体能在细胞内进行蛋白表达。     

犬瘟热病毒GZ-Z株H基因原核表达载体的构建

利用实验室构建的含有犬瘟热病毒H基因的p MD18-H质粒,根据其序列设计带有Bam HⅠ和HindⅢ酶切位点的引物,对H基因ORF进行PCR扩增,得到约1 949 bp的片段。将该片段克隆到p MD18-T载体内,用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切鉴定、质粒PCR鉴定,筛选出阳性克隆。将阳性克隆再用Bam HⅠ和HindⅢ进行双酶切,纯化回收CDV H基因ORF片段;将原核表达载体p ET32a(+)用同样的方法酶切,回收载体片段,并用T4连接酶将以上两回收片段连接,构建原核表达载体质粒p ET32-H,后经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切、质粒PCR、测序进行系列鉴定。结果表明,p ET32-H原核表达质粒构建成功,其中插入片段大小为1 842 bp,可编码607个氨基酸残基。该实验为下一步H蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备奠定了基础。