乙酰氨基阿维菌素缓释注射剂中乙酰氨基阿维菌素含量与有关物质HPLC检测方法的建立

试验旨在建立一种高效液相色谱检测方法,同时测定乙酰氨基阿维菌素(EPR)缓释注射剂的主成分与有关物质,采用外标法计算主成分的含量,采用自身对照法计算有关物质的含量。色谱柱为Phenomenex Luna 5 μ-C8-100A 250 mm×4.60 mm,5 μm;色谱条件为:流动相为乙腈-0.1%高氯酸水溶液,梯度洗脱,流速为1.5 mL/min,检测波长为245 nm,柱温为35 ℃,进样量为20 μL。结果表明,EPR缓释注射剂主成分与杂质分离度良好,B1a与B1b之间分离度>3;在EPR浓度为1.5625~1 000 μg/mL的范围内线性关系良好;EPR的检测限与定量限分别为0.01和0.34 μg/mL,3种精密度的相对标准偏差(RSD)均<2%,稳定性的RSD为0.28%,加样回收率为102.54%,且RSD为3.14%(n=9)。耐用性试验表明,EPR缓释注射剂主成分的分离度均>1.5,理论塔板数>4 500,表明该检测条件的耐用性良好。3批样品中,EPR缓释注射剂含量的平均值为102.60%,B1b占B1a与B1b之和的1.68%,总杂质的平均含量为2.57%。建立的EPR缓释注射剂中主成分含量与有关物质的测定方法具有简便、专属性强、灵敏度高、结果准确等特点,可用于EPR缓释注射剂的质量控制。     

2种头孢氨苄片在比格犬体内的药代动力学及生物等效性试验

[目的] 研究头孢氨苄片受试制剂和参比制剂在比格犬体内的生物等效性。[方法] 采用双周期和双序列交叉设计,将22只健康比格犬随机分成2组,按30 mg/kg BW分别单剂量口服头孢氨苄片受试制剂Trolevis^®300和参比制剂Rilexine^®300,于给药前（0 h）和给药后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、17和24 h从臂头静脉采血。对超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）方法进行特异性、线性、检测限、准确度、精密度、稳定性等方法学考察。利用建立好的UPLC-MS/MS方法测定血浆中的药物浓度,并用WinNonlin^TM 8.1软件对药代动力学参数进行分析计算。[结果] 方法学结果显示,在100~5 000 ng/mL浓度范围内相关性良好,相关系数（R²）≥ 0.99,标准曲线方程为y=10.6828x-176.481;高、中、低3个浓度的相对回收率平均值分别为105.63%、104.35%和102.40%;日内和日间变异系数均<15%;检测限为50 ng/mL,定量限为100 ng/mL。药代动力学结果显示,参比制剂组和受试制剂组药代动力学参数如下：T_max分别为（1.77±0.55）和（2.70±4.68）h;C_max分别为（28.09±5.09）和（26.82±7.94）μg/mL;T_1/2分别为（3.39±1.43）和（3.12±1.05）h;AUC_0-t分别为（121.81±25.80）和（116.34±36.30）μg·h/mL。受试制剂与参比制剂药时曲线相似,且受试制剂与参比制剂C_max、AUC_0-t和AUC_0-∞几何均数的比值分别为99.51%、99.27%和99.30%,其90% CI均在80.00%~125.00%之间。[结论] 本试验建立的UPLC-MS/MS方法准确、可靠,可用于头孢氨苄的浓度测定,且头孢氨苄受试制剂与参比制剂是等效的,临床上均可用于相关疾病的治疗。     

鸡血浆中乙酰氨基阿维菌素HPLC检测法的建立及口服给药后的药代动力学研究

旨在建立鸡血浆中乙酰氨基阿维菌素（EPR）浓度的高效液相色谱（HPLC）检测方法,并进行EPR在鸡体内的药代动力学研究。用甲醇提取血浆中的EPR,并用Sep-Pak C18固相萃取法进行纯化,纯化后的EPR经干燥处理,用三氟乙酸酐和N-甲基咪唑对其进行衍生化,使用荧光HPLC检测。结果表明,在血浆EPR含量为0.1~100 ng/mL范围内,标准曲线线性关系良好,相关系数r=0.9999。检测限（LOD）为0.1 ng/mL,定量限（LOQ）为0.3 ng/mL。批内批间的平均回收率均大于90%,批内变异系数2.81~8.02%,批间变异系数4.32~5.83%。给蛋鸡口服5.0 mg/kg的EPR,EPR在鸡体内的药代动力学参数显示：给药后1.58 h可达最大血药浓度（Cmax）354.27 ng/mL;消除半衰期（T1/2el）为5.52 h;平均滞留时间（MRT）为6.40 h。以上结果说明建立的检测方法灵敏度高、准确度高,干扰少,适用于鸡血浆中EPR含量的检测。药代参数提示EPR在鸡体内的吸收代谢迅速,可较快消除。     

注射用盐酸土霉素的细菌内毒素检查

参照<中国兽药典>二○○○年版一部附录细菌内毒素检查法,研究了注射用盐酸土霉素对细菌内毒素检测的干扰情况,确定0.312 5 mg/mL浓度的供试品溶液对检测无干扰作用,建立了注射用盐酸土霉素的细菌内毒素限量检查方法.     

鸡肌肉组织中左氧氟沙星兽药残留ELISA检测方法的研究

用N-羟基琥珀酰亚胺法把左氧氟沙星（LVL）与牛血清白蛋白（BSA）偶联制备免疫抗原,免疫新西兰大白兔得到LVL的多克隆抗体,建立了LVL间接竞争ELISA方法。结果表明：抗LVL血清效价达1∶212以上,得到标准曲线的线性回归方程为y=-0.289 4x＋0.049 5（R2=0.987 8）,50%抑制浓度（IC50）为64 ng/mL,最低检测限（LOD）为10 ng/mL,标准曲线的线性范围为10～1 000 ng/mL。批内变异系数为3.51%～7.46%,批间变异系数为8.66%～11.89%,鸡肌肉中的LVL添加浓度在10～1 000 ng/ml范围内时,回收率为73.5%～84.36%。本试验建立的ELISA方法能够满足左氧氟沙星兽药残留检测要求。     

鸭疫里氏杆菌二价灭活疫苗制备及免疫效力研究

【目的】根据鸭疫里氏杆菌（Riemerella anatipestifer,RA）血清1型、2型贵州流行株制备二价灭活疫苗,为鸭疫里氏杆菌病的防控及疫苗研制提供研究资料。【方法】以血清1型RA （RA-G06株）、血清2型RA （RA-HS01株）地方流行株为菌种,通过涂板法测定菌株生长曲线,利用改良寇氏法计算菌株对鸭的半数致死量（median lethal dose,LD₅₀）,将2株菌培养至终浓度为1×10¹⁰ CFU/mL后等比例混合,以卡波姆为佐剂制备二价灭活疫苗,经疫苗质量检验后进行雏鸭免疫试验;通过检测免疫鸭血清中特异性抗体水平和攻毒保护试验评价疫苗的保护率,对攻毒试验鸭心脏、肝脏、脾脏和脑组织进行组织病理学观察。【结果】RA-G06株和RA-HS01株均在培养12 h时到达峰值,活菌数分别为2.1×10¹¹和3.3×10¹¹ CFU/mL,LD₅₀分别为1.44×10¹⁰和2.63×10⁸ CFU/mL;制备的疫苗安全性良好,能诱导鸭产生体液免疫;RA-G06株攻毒保护试验结果显示,自研疫苗和商品疫苗保护率均为90%;RA-HS01株攻毒试验结果显示,自研疫苗保护率为90%,商品疫苗保护率为80%;组织病理学结果显示,免疫后各疫苗组对鸭心脏、肝脏、脾脏和脑组织能提供较好的保护效果,且自研疫苗组优势明显。【结论】利用贵州地区流行的RA 1型、2型菌株所制备的卡波姆佐剂灭活疫苗具有明显的免疫效果,能对贵州地区1型、2型鸭疫里氏杆菌病的防控起到重要作用。     

环糊精包合氟苯尼考在猪体内的药代动力学研究

为评价采用新包被工艺生产的氟苯尼考（受试制剂F）与国外同类产品（R1）、国内同类产品（R2）在猪体内的生物等效性并探索其药代动力学特性,本试验采用随机三制剂、三周期自身交叉试验设计,选取6头健康的阉割小公猪（体重15 kg±2 kg）,分别灌胃给药3种制剂,给药剂量为20 mg/（kg·BW）,采用高效液相色谱法测定血浆中氟苯尼考浓度,利用Kinetica 5.0软件分析药代动力学特性,SAS统计软件进行生物等效性评价。结果显示,受试制剂在猪体内的药时曲线符合带时滞的一级吸收一室开放模型,F、R1、R2的峰浓度（C_max）分别为16.0845、18.3287和21.1678 μg/mL,药物达峰时间（T_max）分别为5.0、1.9、1.5 h;药-时曲线下面积_（0-∞）（AUC_0-∞）分别为144.7327、118.2670和123.3715 μg/mL·h;受试制剂相比于两种参比制剂的相对生物利用度分别为122.51%（R1）和117.52%（R2）。结果表明,环糊精包被氟苯尼考有更好的缓释作用,具有更好的生物安全性,药效维持时间长,生物利用度有效提高。     

3种止痢型中兽药液体制剂中非法添加黏菌素的HPLC-PDA检查方法的建立

为建立止痢型中兽药液体制剂中非法添加黏菌素的高效液相-二极管阵列色谱法,采用十八烷基键合硅胶为填充剂,流动相为乙腈∶硫酸钠磷酸水溶液(20∶80),硫酸钠磷酸水溶液∶硫酸钠水溶液(7 g/L)∶磷酸水溶液(6.8%)(50.5∶22.75)。检测波长为215 nm。结果显示,在该色谱条件下,3种止痢型中兽药液体制剂本底色谱峰对黏菌素E_1的测定无干扰;黏菌素E_1在0.04～2 mg/mL浓度范围内线性关系良好;杨树花口服液的检出限为10 mg/mL,板蓝根注射液及小檗碱注射液的检出限均为4 mg/mL;上述3种制剂的添加回收率在95.9%～97.9%之间,表明该方法回收率较好,准确度较高,可用于止痢型中兽药液体制剂中非法添加黏菌素的定性定量检测。     

乳酸菌微生态制剂对冬毛期北极狐生长性能、营养物质消化率及血清生化指标的影响

试验旨在研究乳酸菌微生态制剂对冬毛期北极狐生长性能、营养物质消化率及血清生化指标的影响。选取135日龄、体重相近的健康雌性北极狐40只,随机分为4组,每组10个重复,每个重复1只。Ⅰ组饲喂基础日粮;Ⅱ组饲喂基础日粮+0.02%硫酸黏杆菌素;Ⅲ组饲喂基础日粮+1 mL乳酸菌微生态制剂（乳酸菌活菌数为3×10⁹ CFU/mL）;Ⅳ组饲喂基础日粮+10 mL乳酸菌微生态制剂。结果显示：与对照组相比,添加乳酸菌微生态制剂可显著提高冬毛期北极狐平均日增重（P<0.05）,并显著降低料重比（P<0.05）;可显著提高冬毛期北极狐粗脂肪和总能表观消化率（P<0.05）;添加高水平乳酸菌微生态制剂可显著降低冬毛期北极狐血清总胆固醇水平（P<0.05）。此外,抗生素组北极狐血清谷丙转氨酶水平极显著高于其他各组（P<0.01）,谷草转氨酶水平显著高于对照组（P<0.05）。综上所述,在本试验条件下,当北极狐日采食活乳酸菌数达到3×10⁹ CFU/mL时即可促进其生长,粗脂肪和总能表观消化率显著提高;当北极狐日采食活乳酸菌数达到3×10¹⁰ CFU/mL时,血清总胆固醇水平显著降低;长期添加硫酸黏杆菌素可能造成北极狐肝脏损伤。     

注射用硫酸链霉素细菌内毒素检查法的探讨

按照《中国兽药典》二○○五年版一部[1]中注射用硫酸链霉素细菌内毒素检查法对样品复核检验,试验表明该方法是可行的;并与《美国药典》进行了比较,结果说明《中国兽药典》注射用硫酸链霉素细菌内毒素检查法对细菌内毒素的限值表达比《美国药典》29版[2]更合理、更科学。     

Plasma Endotoxin Concentrations in Clinically Normal and Potentially Septic Equine Neonates

Plasma endotoxin concentrations were measured at 1 to 2 and 5 to 6 days of age in clinically normal foals and in potentially septic neonatal foals admitted to North Carolina State University's Veterinary Teaching Hospital for a variety of conditions. In 1 to 2 and 5 to 6 day old normal foals, median plasma endotoxin concentrations were 2.17 (range, 1.61–2.54; n = 6) and 2.89 (range, 2.61–3.50; n = 7) endotoxin units/mL (EU/mL), respectively. Median plasma endotoxin concentration in potentially septic foals with negative blood cultures or gram positive isolates (n = 8) was 2.73 (range, 0.59–4.04) EU/mL. In hospitalized foals with gram negative isolates (n = 6), median plasma endotoxin concentration was 78.06 (range, 0.76–2,696.41) EU/mL, but individual endotoxin values were only increased in foals that were extremely sick and died within hours of sampling. Plasma endotoxin concentrations were significantly greater in foals with sepsis scores ≥ 11 compared with foals with sepsis scores ≤ 10. Increased plasma endotoxin concentrations appear to predict an unfavorable outcome in septic foals, but normal endotoxin concentrations do not appear to have any predictive value. (Journal of Veterinary Internal Medicine 1993; 7:296–302. Copyright © 1993 by the American College of Veterinary Internal Medicine.)     

氯化氨甲酰甲胆碱注射液细菌内毒素检查方法研究

建立氯化氨甲酰甲胆碱注射液的细菌内毒素检查方法。按《中国兽药典》2005年版一部收载的细菌内毒素检查法进行试验。试验结果表明,当氯化氨甲酰甲胆碱稀释成0.01 mg/mL时,对鲎试剂的凝集反应无抑制作用。可以用细菌内毒素检查法检查氯化氨甲酰甲胆碱注射液的细菌内毒素。     

喷雾-复凝聚法制备小反刍兽疫缓释微囊疫苗的研究

建立了喷雾-复凝聚法制备灭活PPR微囊疫苗的工艺方法,并对制备的疫苗进行了主要性能指标测定和动物试验。结果显示：三批微囊形态均呈不规则长囊状,平均包埋率为42%,包埋前后灭活PPRV抗原活性得到较好保持。制备的灭活PPR微囊疫苗在免疫绵羊后1个月,中和抗体滴度均能达到1∶20以上,均高于小反刍兽疫弱毒疫苗1∶10的质量标准,最高可达到1∶160;且中和抗体滴度至少能持续7个月,呈现出良好的缓释效果,是一种具有广阔应用前景的新型疫苗。     

奶牛静脉血内毒素浓度及其与产奶量的相关性

为调查我国当前主流饲喂方式下奶牛静脉血内毒素浓度的范围及内毒素浓度与产奶量的相关性,本试验首先验证了应用鲎试剂法定量奶牛静脉血中内毒素浓度的可行性,在此基础上,分别检测了安徽牧场 １（６０头,饲粮精粗比 ４５∶５５）、江苏牧场（１５头,按产奶量高低精粗比分别为 ２０∶８０、４５∶５５、５０∶５０）和安徽牧场 ２（１４头,饲粮精粗比 ７０∶３０）共 ８９头奶牛的尾静脉血中内毒素浓度,并进行了内毒素浓度与产奶量的相关性分析。结果表明：鲎试剂法可有效检测奶牛静脉血中内毒素浓度,３个牧场奶牛静脉血中内毒素浓度高低不等,在 ０～１．５０ＥＵ／ｍＬ范围内。奶牛静脉血中内毒素浓度与产奶量之间的相关性皆不显著（Ｐ＞０．０５）,但安徽牧场 ２的相关系数（０．１９５２）大于安徽牧场 １（０．０２０５）和江苏牧场（０．０３７６）。结果提示,鲎试剂法可用于定量检测奶牛血中内毒素浓度,在我国当前的饲喂方式下,奶牛血液中普遍含有内毒素,静脉血内毒素浓度与产奶量无显著相关性。     

烯丙孕素固体分散体的制备及其释放度的测定

研究旨在提高烯丙孕素（altrenogest,ALT）在水中的分散度及其生物利用率。采用溶剂法（乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖）和溶剂-熔融法（聚乙二醇6000、单硬脂酸甘油酯、乳糖）制备ALT固体分散体和缓释硅胶栓剂;分别对ALT的线性关系、固体分散体的稳定性、仪器精密度以及加标回收率进行了考察,并用傅里叶变换红外光谱法（FTIR）和显微镜法对其表观形态进行观察鉴定分析,缓释试验测定14 d内ALT缓释度。结果显示,ALT在1~12 μg/mL浓度范围内具有良好的线性关系（R²=0.9996）,仪器精密度良好（RSD=0.48%）,溶剂法和溶剂-熔融法制备的ALT固体分散体的稳定性考察结果较好,RSD分别为0.57%和0.58%,溶剂法和溶剂-熔融法制备的ALT固体分散体的加标回收率数据之间变异较小,回收率较高;原药和固体分散体的红外光谱图和显微镜成像图均表明形成了ALT固体分散体;溶剂法制备的ALT固体分散体最优组合为ALT∶乙基纤维素∶羟丙基甲基纤维素∶乳糖=1∶0.6∶1∶6;溶剂-熔融法制备ALT固体分散体的最优组合为ALT∶聚乙二醇6000∶单硬脂酸甘油酯∶乳糖=1∶10∶1.5∶6;溶剂法与溶剂-熔融法制备的缓释硅胶栓剂的缓释试验表明,在0~48 h ALT浓度逐步增加,分别于第144和48 h时达到峰值,分别为37.73和30.46 μg/mL,此后分别维持在21和13 μg/mL以上。通过对比,以溶剂法制备的ALT固体分散体缓释效果优于溶剂-熔融法,且该ALT固体分散体的制备方法简单,所用载体原料无毒性,为该固体分散体在体内的进一步应用提供了参考依据。     

蟾酥缓释注射液的免疫佐剂活性

为考察蟾酥缓释注射液体外释药行为,并研究其耳根穴注射免疫佐剂作用。本试验采用紫外分光光度法测定蟾酥缓释注射液在无膜溶出模型中的体外释放度;ICR小鼠皮下注射卵清白蛋白（OVA）,同时耳根穴注射蟾酥缓释注射液,二免2周后分离血清和脾细胞,ELISA法检测血清OVA特异性抗体IgG水平,MTT法检测脾淋巴细胞刺激指数。结果：药物体外释放行为遵循零级动力学方程,其累积药物释放百分率（Q）与时间（t）的回归方程为Q=3.989t＋0.322（r=0.999）;蟾酥缓释注射液和蟾酥注射液耳根穴注射后血清OVA特异性抗体IgG水平和淋巴细胞刺激指数均显著高于正常免疫组（P〈0.05）,其中蟾酥缓释注射液组优于蟾酥注射液组,并减少了注射次数。结论蟾酥缓释注射液具有缓释作用,可以通过穴位注射提高抗原免疫水平。     

血虫净缓释剂的研制及预防鸡卡氏住白细胞虫病效果的评价

采用缓释剂制备技术研制了血虫净缓释注射液，该制剂药物包裹量大，析出量小，粘度均匀，3000r/min离心15分种不分层，且粘度小，便于肌肉注射使用。用含4％血虫净的缓释注射液，以0.5mL只和1mL／只的量分别注射50只110日龄健康海兰白鸡。结果用以上两种剂量给鸡注射，都可有效预防本病一个月，而同时对照的含4％血虫净的水溶剂组没有预防作用。     

星点设计-效应面法优化硫氰酸红霉素肺靶向明胶微球的配方

用星点设计-效应面法优化硫氰酸红霉素明胶微球的处方,以期得到分散性好、粒径符合要求的明胶微球。本研究采用乳化-化学交联法制备,以明胶浓度、油水比例、乳化剂浓度为自变量,微球的平均粒径、载药量、包封率、跨距为因变量对自变量的各水平进行多元线性回归和二项式拟合。根据因变量效应面法选取较佳工艺,并在此基础上制备了硫氰酸红霉素微球,且进行了优化处方的验证。结果显示,二项式模型拟合效果较多元线性回归要好,最佳优化处方为明胶浓度0.156g/mL、油水比例12∶2、乳化剂浓度0.03g/mL,根据优化工艺制备的微球分散性好,平均粒径、载药量、跨距、包封率分别为12.51μm、21.28%、1.51和84.39%。体外释药特性研究表明,该微球符合一级方程规律,具有明显的缓释效果。通过星点设计-效应面法成功建立了处方优化模型,且预测性良好。     

Release of tumor necrosis factor-alpha from bovine alveolar macrophages stimulated with bovine respiratory viruses and bacterial endotoxins

The release of tumor necrosis factor-alpha (TNF-) from cultured bovine alveolar macrophages (BAM) was evaluated following stimulation of BAM with bovine herpesvirus-1 (BHV-1), parainfluenza-3 (PI-3) virus, bovine respiratory syncytial virus (BRSV), Escherichia coli 0111:B4 endotoxin, Pasteurella haemolytica type 1 endotoxin, Pasteurella multocida endotoxin, and virus/endotoxin combinations. A cytotoxic assay system using Georgia bovine kidney cells as targets was used to measure TNF- activity. The cytotoxic activity was neutralized by an anti-human TNF- monoclonal antibody.

Stimulation of BAM with 1 median tissue culture infectious dose (TCID₅₀) of live or ultraviolet (UV)-inactivated PI-3 virus/cell resulted in release of TNF- in significantly (P<0.05) higher amounts than sham-induced BAM. The quantities of TNF- released after live or UV-inactivated BHV-1 or BRSV induction were not significantly higher than sham-induced BAM. E. coli 0111:B4, P. haemolytica type 1 and P. multocida endotoxins stimulated TNF- release in a dose-dependent manner. Sequential exposure of BAM to 1 TCID₅₀ per cell of either live BHV-1, PI-3 virus or BRSV and then 5 μg ml⁻¹ of either E. coli 0111:B4, P. haemolytica type 1 or P. multocida endotoxin caused a significant (P<0.05) reduction in detectable TNF- in seven of nine virus/endotoxin combinations tested, when compared with 5 μg ml⁻¹ of endotoxin alone. Parainfluenza-3 virus/endotoxin combinations stimulated higher TNF- release when compared with other virus/endotoxin combinations. Five out of six test animals had serum-neutralizing antibodies to PI-3 virus, one out of six had serum-neutralizing antibodies to BHV-1, and two out of six had serum-neutralizing antibodies to BRSV, suggesting a possible relationship between serum neutralizing antibodies and TNF- release from in vitro cultivated BAM.