胎牛血清对猪孤雌胚早期体外发育的影响

探讨了在猪孤雌胚体外发育的第3、4、5、6天分别添加胎牛血清(FCS)对孤雌胚发育能力的影响.结果,在体外培养的第5,6天添加10%FCS组得到的囊胚率和囊胚孵化率最高,第5天添加FCS组的囊胚细胞数最多.结果表明,FCS可以促进猪孤雌胚胎的早期体外发育.     

胰岛素和白血病抑制因子对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎的影响

为探讨胰岛素(Insulin)和白血病抑制因子(Leukemia inhibit factor,LIF)对猪卵母细胞体外成熟(IVM)和猪孤雌激活胚胎(PAEs)的影响,在卵母细胞体外成熟或者胚胎培养基中添加Insulin和LIF,研究卵裂率和囊胚率的变化。结果:添加了5μg/mL Insulin后猪卵母细胞体外成熟效果显著提高,但成熟后孤雌激活发育能力与非添加组相近;而胚胎培养基中添加Insulin对孤雌胚的卵裂和囊胚的形成也没有明显促进作用;添加1 000 U/mL的LIF后,卵母细胞核成熟率没有明显提高,反而孤雌激活后囊胚率急剧下降,但对卵裂率以及囊胚总细胞数影响不大;在胚胎培养基中添加LIF后,孤雌胚的卵裂和囊胚形成并没有明显的提高。表明:Insulin对卵母细胞体外成熟有益,但是对孤雌胚胎的最佳处理程序还需要摸索;本文所采用的LIF处理对猪卵体外成熟以及孤雌胚胎体外发育没有帮助,还需要进一步研究其他浓度和处理程序对猪卵母细胞体外成熟和孤雌激活胚胎发育能力的影响。     

不同共培养细胞类型对绵羊孤雌生殖胚发育的影响

体外成熟的绵羊卵母细胞经孤雌激活4 h后,分别在5种体细胞单层(成熟前颗粒细胞、成熟后颗粒细胞、输卵管壶腹部上皮细胞、输卵管峡部上皮细胞、子宫内膜细胞)中进行共培养,比较其对绵羊孤雌生殖胚体外发育的影响.结果表明:成熟前后颗粒细胞对绵羊孤雌胚体外发育的卵裂率和囊胚率差异不显著(P>0.05);但输卵管壶腹部上皮细胞(27.5%)、子宫内膜细胞组囊胚率(27.7%)高于输卵管峡部上皮细胞和颗粒细胞(17.7%、20.3%),且差异显著(P<0.05);壶腹部上皮细胞与子宫内膜细胞在囊胚率上差异不显著(P>0.05).说明在绵羊孤雌生殖胚体外发育中,选择成熟前及成熟后的颗粒细胞都可达到相同的共培养效果;使用输卵管壶腹部上皮细胞、子宫内膜细胞进行共培养效果优于输卵管峡部上皮细胞和颗粒细胞,可以得到较高的囊胚率.     

提高猪囊胚后期贴壁能力的优化培养体系

为了提高猪孤雌囊胚贴壁率,试验从饲养层及培养液两方面研究猪孤雌囊胚贴壁能力;用小鼠、猪和牛的胎儿成纤维细胞制作饲养层,分别添加DMEM、NCSU-23、DMEM/NCSU-23培养液,探讨猪孤雌囊胚在3种饲养层上的发育效果。结果表明,BEF饲养层能更好地促进猪孤雌囊胚贴壁生长,其囊胚贴壁率为33.67%,与MEF饲养层组的囊胚贴壁率(19.08%)之间差异显著(P0.05),与PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05),MEF饲养层组和PEF饲养层组之间囊胚贴壁率差异不显著(P0.05);在BEF牛胎儿成纤维细胞饲养层组,用猪胚胎培养液NCSU-23培养猪孤雌囊胚后,囊胚贴壁率(22.53%)显著高于DMEM培养液组(10.41%)和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组(12.05%)(P0.05),DMEM培养液组和DMEM/NCSU-23培养液半量混合组之间差异不显著(P0.05)。牛胎儿成纤维细胞饲养层和猪胚胎培养液NCSU-23能更好地促进猪孤雌囊胚后期贴壁。     

不同发育天数及囊胚类型对猪孤雌激活胚胎冷冻效果的研究

实验比较不同发育天数所得的早期囊胚和扩张囊胚的冷冻效果,以期找出冷冻前胚胎最佳发育时期及囊胚类型。以猪孤雌激活胚胎为材料,分别取培养到第5、6、7天所得的早期囊胚(EB)和扩张囊胚(B)进行玻璃化冷冻保存,解冻后对其复苏率和内细胞团数损伤进行观察和统计。结果表明:发育第5天所获早期囊胚和扩张囊胚复苏率(32.26%、44.78%)好于第6天(22.45%、35.09%)和第7天(8.33%、32.65%),各发育天数所获扩张囊胚复苏率差异不显著(P>0.05),发育至第5天和6天的早期囊胚复苏率显著高于第7天(P<0.05);在内细胞团损伤比例上,虽各组差异不显著(P>0.05),但第5天和第6天组损伤低于第7天组。结果提示,在孤雌激活后第5天选取扩张囊胚进行冷冻,解冻后所得冷冻效果好。     

牛孤雌激活囊胚冷冻复苏后胚胎存活率和胚胎质量

使用2种不同的冷冻载体冷冻保存牛孤雌囊胚,并且使用差异染色的方法计数囊胚细胞数。结果显示,开放式毛细玻璃管(GMP)和冻精管(Straws)冷冻牛孤雌囊胚复苏后囊胚孵出率存在显著性差异(GMP法为70.29%,冻精管法为27.31%,P0.05)。差异染色结果显示,牛囊胚冷冻复苏后囊胚细胞数目为91.37,而对照组(正常孤雌囊胚)囊胚细胞数目为93.70,两者差异不显著(P0.05),并且前者内细胞团数(ICM)与滋养层细胞数(TE)比例为0.23,而后者为0.24,差异不显著(P0.05)。结果表明,GMP法更适合冷冻保存牛孤雌囊胚,并且其冷冻复苏后囊胚的孵出率达到70.29%。同时使用GMP冷冻囊胚对囊胚细胞的损伤较小。     

FBS和不同培养液对牛孤雌胚体外发育的影响

研究培养液中血清的添加时间和添加浓度及不同培养体系对牛孤雌胚胎体外发育潜力的影响。结果表明：牛成熟卵母细胞孤雌激活后的第3天添加10％的FBS对孤雌胚的体外发育效果；良好。4种培养体系在孤雌激活后的第3天添加10％的FBS，平均囊胚率分别可达46．25％（SOFaar）、43．58％（CRlaa）、40．25％（KSOMaa）、17．98％（TCM199）；TCM199组的囊胚率显著低于其他3组（P〈0.05），SOFaa优于CRlaa和KSOMaa组，但差异不显著（P〉0．05）。     

山羊卵母细胞孤雌激活及孤雌胚的体外培养

为了比较不同的激活方法对卵母细胞孤雌激活的影响,以及培养液(CR1aa)中添加不同类型的血清对孤雌激活胚体外发育的影响。采用Eth 6-DMAP、A23187 6-DMAP和Ion 6-DMAP三种方法激活山羊卵母细胞,Eth 6-DMAP组孤雌激活胚的卵裂率和囊胚率(35.2%和4.8%)显著低于A23187 6-DMAP组(68.9%和24.1%)和Ion 6-DMAP组(88.1%和48.0%),表明以Ion 6-DMAP激活最为理想。在培养液(CR1aa)与颗粒细胞共同培养条件下,分别添加100 mL/L的发情牛血清(OCS)、胎牛血清(FBS)和新生牛血清(NCS)。添加OCS和FBS后,孤雌胚囊胚率分别为48.1%和45.0%,显著高于添加NCS组(26.0%)。表明OCS、FBS和NCS能有效的提高孤雌胚的体外发育能力,尤其是对提高孤雌胚的囊胚发育能力更佳。     

FBS和不同养液对牛孤雌胚体外发育的影响

研究培养液中血清的添加时间和添加浓度及不同培养体系对牛孤雌胚胎体外发育潜力的影响.结果表明:牛成熟卵母细胞孤雌激活后的第3天添加10%的FBS对孤雌胚的体外发育效果良好.4 种培养体系在孤雌激活后的第3天添加10%的FBS,平均囊胚率分别可达46.25%(SOFaa)、43.58%(CRlaa)、40.25%(KSOMaa)、17.98%(TCM199);TCM199组的囊胚率显著低于其他3组(P＜0.05),SOFaa优于CRlaa和KSOMaa组,但差异不显著(P＞O.05).     

猪孤雌激活4-细胞胚胎玻璃化冷冻保存效果的研究

本实验旨在研究猪孤雌激活4-细胞胚胎的冷冻保存效果。胚胎采用Cryotop法进行玻璃化冷冻保存,解冻后分析其存活率、胞内活性氧(ROS)和谷胱甘肽(GSH)水平、囊胚发育率及囊胚质量。结果表明:冷冻胚胎体外恢复2 h的存活率与新鲜胚胎无明显差异(100%vs.96.8%,P0.05),但当其培养时间达到24 h时,存活率显著下降至88.3%(P0.05)。另外,玻璃化冷冻导致胚胎内ROS水平显著升高(P0.05),GSH水平显著下降(P0.05)。与新鲜胚胎相比,冷冻胚胎获得的囊胚发育率明显降低(59.8%vs.26.4%,P0.05),但囊胚的凋亡细胞率、内细胞团数、滋养层细胞数及总细胞数均无明显差异(P0.05)。结果显示,玻璃化冷冻猪孤雌激活4-细胞胚胎导致其存活、氧化还原能力和囊胚发育下降,但仍能获得较高质量的囊胚。     

亚胺环己酮对猪卵母细胞人工孤雌激活作用的研究

本文以体外成熟的猪卵母细胞为材料，以乙醇、电脉冲和氯化锶为人工刺激条件，研究了蛋白质合成抑制剂－亚胺环己酮（CHX）对猪卵母细胞的孤雌激活效果的影响。结果表明，乙醇、电脉冲和SrCl2均可使猪母细胞激活，而电脉冲的活效果最好。当分别与CHX联合使用时，激活率显著高于单独的乙醇、电脉冲或SrCl2刺激。说明，CHX与乙醇、电脉冲及SrCl2联合使用对猪IVM卵母细胞激活具有显著的协同促进作用。     

奶牛四分胚分割研究

用玻璃针四等分7天的奶牛胚胎为四分(1/4)胚。同一胚胎2个四分胚装回空透明带内,另2个四分胚不装带,成对非手术移给受体奶牛。两次试验共分割胚胎(晚桑椹到囊胚期)11枚,得到42个四分胚。移植受体32头,有3头妊娠。最后,一头受体生出一对同卵双胎四分胚母犊,另一头产一四分胚母犊,均由装带四分胚发育而来。还有一头受体产一四分胚公犊,是由未装带的四分胚发育得到的。试验还分割一个8天囊胚,把一个无带四分胚先放在体外培养24小时再移入受体。结果获得一头四分胚母犊。     

山羊冻胚分割试验

将冷冻-解冻后的琼脂包被孵出胚泡分两组,分别置于12％蔗糖液(A)和磷酸缓冲液(B)中进行2分切割。在体外培养12小时后,A、B两组的半胚发育率分别为68.9％(31/45)和58.3％(35/60)。A组的冻胚分割效果显著好于B组(P<0.05)。将早期囊胚、扩张囊胚、孵出胚泡和琼脂包被孵出胚泡冷冻-解冻后,在12％蔗糖液中分割为2(A、B、C、D组)。在体外培养12～24小时后,A、B、C、D4组的半胚发育率分别为47％(14/30)、 50％(15/30)、27％(8/30)和70％(21/30)。D组的冻胚分割效果显著好于A、B两组(P<0.05)极显著地好于C组(P<0.01)。将5枚在冷冻前用琼脂包被的孵出胚泡在12％蔗糖液中分割为二后移植于5只受体,结果有4只妊娠,共产半胚羔6只,其中2对为同卵双生。本研究证明,在蔗糖液中分割冻胚可提高半胚体外成活率;分割从琼脂释放出的解冻孵出胚泡可提高山羊冻胚分割的效果。     

牛、羊卵母细胞孤雌激活的研究

本试验主要比较了离子霉素、电脉冲两种方法激活牛、羊体外成熟卵母细胞的效率。两种激活方法中。牛胚胎卵裂率无显著差异（90．61％对94．40％，P〉0．05），而离子霉素激活胚胎的囊胚发育率极显著高于电激活方法（12．3％对2．4％，P〈0．01）。两种方法对羊胚胎的研究中，羊胚胎卵裂率无显著差异（72．4％对77．4％，P〉0．05）。但是离子霉素激活胚胎的囊胚发育率显著高于电激活方法（3．67％对10．40％，P〈0．05）。本试验中还比较了用化学激活法（离子霉素）激活牛体外成熟卵母细胞后，用SOFaa体系培养，换液与不换液对孤雌激活胚胎体外发育的影响。结果表明：在第4天不换液的胚胎卵裂率和囊胚率极显著高于换液的胚胎（11．64％对3．49％。P〈0．01）。     

Demands for carbohydrates as major energy substrates depend on the preimplantation developmental stage in pig embryos: Differential use of fructose by parthenogenetic diploids before and after the 4-cell stage in the pig

The embryo culture technique has been improving, but the detailed demands for energy substrates such as glucose, fructose, pyruvate and lactate of preimplantation embryos are still unclear. In the present study, the demands of pig preimplantation embryos at each different developmental stage were investigated by use of parthenogenetic diploids as a model of pig preimplantation embryos. Pig parthenogenetic diploids showed different use of glucose and fructose before and after the 4-cell stage. Although glucose supported the development of pig embryos throughout the preimplantation stages and even maintained the expansion and hatching of blastocysts, it suppressed development to the blastocyst stage when glucose coexisted with pyruvate and lactate from 4 h after activation, but not after 48 h (early 4-cell stage). Since ketohexokinase that metabolizes fructose was not expressed in 2-cell and 4-cell diploids, a medium that included only fructose as a major energy substrate did not support early cleavage of pig diploids beyond the 4-cell stage, and almost no diploids developed to the morula stage just as in a medium without carbohydrates. These results may explain the different suppressive effects on pig preimplantation development between glucose and fructose when pyruvate and lactate were present in a medium. In addition, 4-cell diploids that had been cultured in a medium with pyruvate and lactate developed to the expanded blastocyst stage without any carbohydrates as a major energy substrate. These results show that the demands for carbohydrates are different depending on the developmental stage in pig preimplantation embryos.     

电脉冲及6-DMAP对小鼠卵母细胞孤雌激活的研究

实验研究了不同电脉冲条件、6-DMAP作用不同时间以及二者联合使用时对注射hCG后18～19h采集的小鼠卵母细胞孤雌激活及发育的效果。结果表明:小鼠卵母细胞电激活后,放入2mmol/L6-DMAP的CZB中作用6h,其激活率和囊胚率都显著高于单独使用一种激活方法。其中场强2.0kv/cm,脉宽80μs,3次脉冲结合6-DMAP组的激活率和囊胚发育率最高,与其他两组差异显著。     

No effect of exogenous melatonin on development of cryopreserved metaphase II oocytes in mouse

Background

This study was conducted to investigate effect of exogenous melatonin on the development of mouse mature oocytes after cryopreservation.

Results

First, mouse metaphase II (MII) oocytes were vitrified in the open-pulled straws (OPS). After warming, they were cultured for 1 h in M₂ medium containing melatonin at different concentrations (0, 10⁻⁹, 10⁻⁷, 10⁻⁵, 10⁻³ mol/L). Then the oocytes were used to detect reactive oxygen species (ROS) and glutathione (GSH) levels (fluorescence microscopy), and the developmental potential after parthenogenetic activation. The experimental results showed that the ROS level and cleavage rate in 10⁻³ mol/L melatonin group was significantly lower than that in melatonin-free group (control). The GSH levels and blastocyst rates in all melatonin-treated groups were similar to that in control. Based on the above results, we detected the expression of gene Hsp90aa1, Hsf1, Hspa1b, Nrf2 and Bcl-x1 with qRT-PCR in oocytes treated with 10⁻⁷, or 10⁻³ mol/L melatonin and untreated control. After warming and culture for 1 h, the oocytes showed higher Hsp90aa1 expression in 10⁻⁷ mol/L melatonin-treated group than in the control (P < 0.05); the Hsf1, Hsp90aa1 and Bcl-x1 expression were significantly decreased in 10⁻³ mol/L melatonin-treated group when compared to the control. Based on the above results and previous research, we detected the development of vitrified-warmed oocytes treated with either 10⁻⁷ or 0 mol/L melatonin by in vitro fertilization. No difference was observed between them.

Conclusions

Our results indicate that the supplementation of melatonin (10⁻⁹ to 10⁻³ mol/L) in culture medium and incubation for 1 h did not improve the subsequent developmental potential of vitrified-warmed mouse MII oocytes, even if there were alteration in gene expression.     

鸡抗球虫药的体外筛选综述

抗鸡球虫药的筛选分为体内筛选和体外筛选。体外筛选具有简易、迅速、准确和经济的优点。本文在前人大量工作的基础上，总结了体外筛选的全过程，并分述了细胞培养筛选法和鸡胚培养筛选法。