东方田鼠皮肤成纤维永生化细胞的建立

为建立东方田鼠皮肤成纤维细胞(MfSF)系,本研究采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的pSV3neo重组质粒导入原代MfSF中,通过G418筛选,阳性克隆扩大培养,建立永生化MfSF系.实验结果表明,阳性细胞克隆在G418筛选第三周后出现,经扩大培养已稳定传代达42代,而且生长状态良好,PCR及RT-PCR检测结果表明,SV40 T基因已整合到MfSF中并稳定表达.本研究利用SV40 T基因导入制备了永生化MfSF细胞系,为动物间成纤维细胞比较研究及相关病原的研究提供了敏感细胞系.     

脂质体介导SV40T基因构建东方田鼠成纤维细胞永生系技术体系的建立

为了优化脂质体介导SV40T基因转染东方田鼠成纤维细胞的条件,提高其转染效率,试验采用脂质体基因转染法将含有SV40T基因的p SV3 neo质粒导入东方田鼠成纤维细胞中,经过G418培养基加压筛选、阳性细胞克隆的筛选及扩大培养、永生化细胞中SV40T基因的整合与表达检测、永生系细胞生长曲线测定等步骤,成功构建了东方田鼠成纤维细胞永生系。结果表明:采用SV40T基因单导入的方法,可成功构建东方田鼠成纤维细胞永生系。     

pcDNA3．0—SV40T重组表达质粒的构建及鉴定

选用pGEM-SV40 T质粒经XhoI单阵切获得SV40 T基因片段,并将其插入pcDNA3. 0载体,构建重组质粒pcDNA3.0-SV40T,为建立永生化细胞系奠定基础。结果表明:经醉切鉴定证实,SV40T基因片段已经成功播入载体中.构建的SV40病毒T杭原重组质粒为利用SV4oT杭原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具。     

pcDNA3.0-SV40T重组表达质粒的构建及鉴定

选用pGEM-SV40 T质粒经XhoI单酶切获得SV40 T基因片段,并将其插入pcDNA3.0载体,构建重组质粒pcDNA3.0-SV40 T,为建立永生化细胞系奠定基础。结果表明,经酶切鉴定证实,SV40T基因片段已经成功插入载体中。构建的SV40病毒T抗原重组质粒为利用SV40T抗原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具。     

SV40LT抗原介导的蝙蝠胎儿肾细胞永生化

蝙蝠是许多新发人兽共患病病毒的自然储存宿主,由于缺乏蝙蝠细胞系,只能利用其他哺乳动物细胞系来分离蝙蝠病毒,因此成功分离的几率较低。为建立稳定的蝙蝠细胞系,本研究利用胰酶消化法培养东亚水鼠耳蝠(Myotis petax)的胎儿原代肾细胞。利用重组逆转录病毒转导法将SV40 LT抗原基因转导入蝙蝠胎儿原代肾细胞,经嘌呤霉素筛选获得LT基因整合和表达的阳性细胞,并进行连续传代培养。RT-PCR和western blot检测表明转导的细胞中有SV40 LT基因的整合和表达。转导细胞在软琼脂中培养不能够形成克隆,表明其未发生癌性转化。对第33代的转导细胞进行单细胞克隆,获得了3个衍生的细胞系,其中Mp-Ki03细胞系已培养至第60代。病毒感染试验表明蝙蝠西江病毒和蝙蝠轮状病毒均可以感染该转导细胞系。本研究通过SV40 LT抗原建立了永生化的蝙蝠胎儿肾细胞系,并且该细胞系对蝙蝠病毒易感,对分离与鉴定蝙蝠病毒以及研究病毒感染蝙蝠细胞的机制具有重要的作用。     

不同动物原代细胞的永生化方法及其应用

细胞永生化是一项运用多种手段人为地将不同类型的外源性永生化基因导入目的细胞,打破细胞的正常分裂周期并使其具备无限增殖能力的技术,现已被广泛应用于不同动物原代细胞中。为了探究促使细胞永生化的几种常用方法如何介导细胞永生化,不同方法之间的相关因素有何关联和区别,以及这些方法如何应用到不同动物的细胞中,本文通过对几种促使细胞永生化的作用机制、方法及其在不同动物细胞(如猪单核细胞/巨噬细胞系、牛肠上皮细胞系、牦牛瘤胃上皮细胞系、鸡前脂肪细胞系、鸡胚胎成纤维细胞系、鸭肠上皮细胞系、兔黑色素细胞系和斑节虾淋巴细胞系等)中的应用现状进行概述,发现细胞永生化主要涉及端粒与端粒酶激活、病毒基因[如人类疱疹病毒(EBV)、猴空泡病毒40(SV40)和人乳头瘤病毒(HPV)基因]的转染整合,以及运用Cre-LoxP介导的重组系统对细胞进行可回复性永生化等多个方法,且其核心都是对细胞端粒酶活性的调控。此外,不同动物细胞可通过上述多种方法实现永生,但是也有极少部分细胞受其自身性质的影响,只可选择某一特定方法。因此,对不同动物原代细胞永生化方法及其应用进行研究,不仅可为建立具备功能性的永生化细胞系提供理论依据,也...     

SV40T基因对绵羊子宫内膜上皮细胞和基质细胞体外增殖的影响

本研究旨在通过SV40T基因导入来提高绵羊的子宫内膜上皮细胞(EECs)和基质细胞(ESCs)的体外传代次数,为绵羊胚胎附植等子宫相关研究奠定基础。采用酶促分离获得原代绵羊EECs和ESCs,并用携带SV40T基因的慢病毒以MOI 1:10和MOI 1:50感染并进行单克隆细胞株筛选。结果表明,所得EECs和ESCs分别具有上皮和基质细胞典型特征(上皮细胞呈铺路石状,基质细胞呈梭形)并表达特异性标记蛋白细胞角蛋白(Cytokeratin)和波形蛋白(Vimentin);EECs传至约50代,ESCs传至约30代后,光学形态观察、SV40T基因表达、标记蛋白免疫荧光及血清依赖性检测结果表明两类细胞形态未发生变化,均表达SV40T基因,并具有上皮细胞特性和基质细胞特性,伴有较强的血清依赖性,证实成功建立了EECs和ESCs细胞株;生长曲线和SV40T基因拷贝数检测结果显示ESCs的增殖能力要强于EECs,MOI 1:10和MOI 1:50感染下,SV40T基因拷贝数差异不显著。以上结果提示,SV40T基因能够大大增强绵羊EECs和ESCs体外增殖能力并延长其寿命,为绵羊胚胎附植等子宫相关研究提供了素材。     

人端粒酶催化亚基和SV40大T抗原永生化猪脐静脉血管内皮细胞

为建立稳定的猪血管内皮细胞系,用于猪瘟病毒(CSFV)的致病机理研究提供理想的细胞模型,本研究利用逆转录病毒分别转导人端粒酶催化亚基(hTERT)基因或SV40大T抗原(SV40 LT)基因进入猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC),通过G418或嘌呤霉素筛选阳性克隆,并进行细胞传代研究和细胞形态学及表型鉴定。分别获得了两种方法建立的永生化猪血管内皮细胞系SUVEC-hT和SUVEC-ST。两种细胞系均呈铺路石样单层排列生长,具有高度的增殖活性,在传代70代后不表现任何衰老细胞的特征,并保持接触生长抑制。SUVEC-hT细胞系持续表达hTERT、CD31、CD34和von Willebrand factor,并能摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-Ac-LDL)。SUVEC-ST细胞系持续表达SV40 LT、CD31和CD34,并能摄取Dil-Ac-LDL。两个细胞系均保持正常的核型并对CSFV敏感。结果表明通过表达外源的hTERT或SV40 LT,SUVEC已被永生化,并且保留了血管内皮细胞的主要生物学特征。     

细胞永生化技术研究进展

细胞永生化作为细胞生物学研究的热点,在细胞实验中发挥很大的作用,使目的细胞永生化,建立永生化细胞系,可以更好地开展细胞实验。细胞永生化技术的成功应用,不仅为生物实验研究提供了有力的工具,也为有效准确地诊断疾病提供了新道路。本文在细胞永生化基本机制的基础上,就细胞永生化技术方法、检测方法以及存在的问题等方面研究进展进行概述。     

转基因畜禽的研究进展

转基因动物是指以实验方法导入的外源基因在其染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物.自Mintz等(1979)将猴腺病毒伴随病毒(SV40)DNA导入小鼠早期胚胎的囊胚腔,得到了第一个承载有人工导入外源基因的嵌合体小鼠以来,在短短的十多年里,国内外关于转基因的研究渗透到了生物学的各个领域,为许多基因研究提供了大量宝贵的资料[1].     

崂山奶山羊骨髓间充质干细胞永生化细胞系的建立

为建立崂山奶山羊骨髓间充质干细胞(BMSCs)永生化细胞系,将已构建的pcDNA3.1-EGFPTERT转入崂山奶山羊BMSCs中,利用含G418的培养基筛选获得稳定转染的TERT-BMSCs;通过多次传代,测定其生长曲线;选取高代次TERT-BMSCs的分裂中期相的细胞,检测其染色体及核型的稳定性。结果表明,转入TERT基因的崂山奶山羊BMSCs能够稳定表达该基因,其生长曲线呈"S"形;在多次传代后,P40代细胞的核型正常率仍能达到88.24%。综上提示,转染得到的TERT-BMSCs具有良好的生长状态,其细胞生长稳定,符合永生化细胞特征,为间充质干细胞应用于组织修复及基因工程种子细胞的制备提供了理论基础。     

猴病毒SV40的灭活及鉴定

猴病毒 SV40 ( Simian Virus40 )在自然状态下感染恒河猴 ,导致急性病变或长期携带感染 ,影响实验用猴质量。本文研究了灭活SV40的方法 ,发现在经 1 .5mol/ L Mg Cl2 ,56℃作用 1 2 d后 ,SV40能被彻底灭活 ,灭活后的SV40不能引起细胞病变。灭活样品经测定蛋白含量为 0 .1 88mg/ m L。PCR检测表明灭活样品感染 vero细胞中 SV40 T抗原 C末端基因稳定存在 ,EL ISA检测表明灭活后的 SV40具有免疫原性。并探讨了灭活 SV40预防恒河猴感染SV40的可行性。     

永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系的建立

[目的]建立永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系,为基础研究和动物病毒的研究提供稳定的体外细胞模型。[方法]采用组织块贴壁法培养绵羊瘤胃成纤维细胞（ovine ruminal fibroblasts cells,ORFCs）,利用PEI试剂将带有hTERT基因的pCI-neo-hTERT质粒转染ORFCs,经G418筛选得到阳性克隆细胞。采用RT-PCR、Western Blot检测F₁₅和F₃₅代阳性克隆细胞的hTERT基因的转录和表达情况;利用血球计数法绘制原代ORFCs和F₃₅代阳性克隆细胞的生长曲线比较其增殖能力。[结果]将hTERT基因成功转入ORFCs并稳定表达;阳性克隆细胞的增殖能力显著高于原代ORFCs。[结论]该试验成功建立了永生化绵羊瘤胃成纤维细胞系。     

细胞永生化的研究进展

永生细胞系具有无限增殖能力,其自我更新能力、增殖分化模式、基因表达调控以及癌症等疾病研究一直以来也是分子细胞生物学领域的研究热点与难点。细胞永生化是指细胞在体外培养的时候,由于自身基因改变或者外界因素刺激,例如细胞周期检查点通路受损、端粒酶的再次激活上调、原癌基因激活等影响,使细胞分裂加快,并突破了自我衰老与凋亡机制,从而实现了无限增殖,可以进行长期传代培养。目前,科研人员已成功建立了很多不同物种、不同组织来源的永生化细胞系,在研究真核细胞发育、分子调控机制等方面发挥了重要作用,但是细胞发生永生化的分子机制和影响细胞永生的因素还需要继续探索。本文综述了目前已发现的部分细胞永生化机制,以及各种不同组织来源永生化细胞系的重要性,为揭示更多的细胞永生化机制和细胞系建立方法提供基础。     

猪瘟病毒石门株E2基因在永生化猪血管内皮细胞的表达

利用DNA重组技术将猪瘟病毒石门株囊膜蛋白E2基因定向插入逆转录病毒载体pBABE-puro中,构建重组逆转录病毒载体pBABE-puro-E2。将pBABE-puro-E2和辅助质粒pVSV-G经磷酸钙共沉淀法转染293GP包装细胞系,将其包装为完整的逆转录病毒假病毒;用包装好的假病毒在polybrene的介导下转导第30代的永生化猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）,用嘌呤霉素筛选阳性细胞,并将筛选出的阳性细胞腹腔免疫BALB／c小鼠。RT-PCR检测SUVEC内的E2基因,用间接免疫荧光试验鉴定E2蛋白在SUVEC上的表达,间接ELISA试验检测小鼠血清抗体。结果表明,CSFVE2基因导入猪脐静脉血管内皮细胞获得表达,而且成功诱导小鼠产生抗E2蛋白的抗体。     

慢病毒载体表达系统的研究进展

作为运载工具,慢病毒载体将插入的目的基因导入至宿主细胞内,目的基因由此可于宿主细胞内进行复制或表达,因其具有广阔的宿主范围且能更加有效地引起细胞感染而被视为常用的基因导入方式之一。本文围绕慢病毒载体的构成、慢病毒载体表达系统的优势及演变等,开展相关研究状况的系统综述。     

马疱疹病毒1型调控蛋白对SV40早期启动子的调控

为研究马疱疹病毒1型(EHV-1)6种调控蛋白(极早期调控蛋白IEP、早期调控蛋白EICP0、EICP22、EICP27、IR2P和晚期调控蛋白ETIF)对猴空泡病毒40(SV40)早期启动子(SV40EIp)的调控作用,本研究将这6种EHV-1调控蛋白真核表达重组质粒分别与SV40EIp萤火虫荧光素酶重组报告质粒共转染RK13细胞,并同时转染作为内控的海肾荧光素酶报告质粒,通过检测两种独立的报告酶与对应底物反应后的发光强度,得到SV40EIp活性相对值。从而评价EHV-1 6种调控蛋白对SV40EIp活性影响。结果表明:ETIF对SV40EIp活性影响不显著;IR2P对SV40EIp活性具有下调作用;IEP、EICP0、EICP22、EICP27对SV40EIp活性均具有上调作用;而对于含增强子的SV40EIp(SV40EIp E),这4种调控蛋白也能够上调SV40EIp E活性,其中EICP22上调作用最强。而且,EICP22和EICP27能够协同上调SV40EIp的活性。此外,EICP22与EHV-1早期基因启动子转录因子TBP、EICP27与TBP及EICP22与EICP27的免疫共沉淀试验(Co-IP)结果表明:仅EICP27可以与TBP发生相互作用,提示EICP22并非与EICP27或者TBP直接结合而实现协同上调作用,其协同上调作用还存在其他的作用方式。     

端粒酶在细胞永生化中的应用

细胞永生化是目前细胞生物学研究的热点和难点之一。位于真核生物细胞染色体末端的端粒可以稳定染色体,而由RNA和蛋白质组成的端粒酶以自身RNA为模板合成端粒。因此,将外源性端粒酶逆转录酶（TERT）基因转染至目的细胞,则可能诱导细胞发生永生化。本文从端粒、端粒酶、端粒酶在细胞永生化中的应用、端粒酶在传代细胞系中的应用、存在问题与展望等五个方面进行了综述,以期为相关研究人员提供参考。     

hTERT永生化山羊子宫内膜基质细胞系的建立及其致瘤性

为了检测转染人端粒酶逆转录酶催化亚单位(human telomerase reverse transcrip tase,hTERT)后建立的山羊永生化子宫内膜基质细胞(endometrium stromal cells,ESCs)是否存在潜在致瘤性。将hTERT导入2代山羊ESCs中建立永生化山羊ESCs(hTERT-ESCs),利用免疫细胞化学方法鉴定细胞并检测hTERT导入后细胞端粒酶活性的表达;分别取2代山羊ESCs和55代hTERT-ESCs,使用含不同浓度血清的培养液培养,利用MTT法检测其血清依赖性;软琼脂克隆形成试验检测hTERT-ESCs在半固体培养基中的克隆形成能力,同时测定hTERT-ESCs的生长曲线。结果显示:转染后获得的阳性克隆细胞及其传代细胞呈长梭形和三角形,与原代细胞形态一致,波形蛋白检测阳性,角蛋白检测阴性;免疫细胞化学方法显示hTERT阳性;hTERT-ESCs在含不同血清培养基中生长速度不同,具有血清依赖性;软琼脂克隆试验显示2代山羊ESCs和55代hTERT-ESCs均不能在软琼脂中生长;hTERTESCs具有正常体细胞生长曲线。证明hTERT-ESCs基本保持了正常山羊ESCs的生物学特性,不具有致瘤性。