肌动蛋白结构及生物学功能的研究进展

肌动蛋白是真核生物中最丰富的蛋白质之一,分布于整个细胞中,能通过聚合形成微丝。微丝是细胞支架的重要组成部分,维持细胞形态,同时能参与细胞的许多生物学过程。随着对肌动蛋白生物学特性研究的不断深入,它在分子生物学及动物病理学中的应用受到广泛的关注。本文从分子生物学水平对肌动蛋白的结构、装配动力学以及生物学功能进行系统综述,为肌动蛋白的研究提供相关重要信息。     

猪CFL2基因cDNA的克隆与序列分析

动物肌肉是人们蛋白质的主要来源之一,其基本组成单位是肌纤维.近年来,猪肉品质已成为猪遗传育种学家研究的热点和难点问题.研究表明,肌肉的组成结构和肌纤维的组织学特性与肉品品质,特别是食用品质性状密切相关.肌动蛋白是构成肌节细肌丝和细胞骨架的主要成分,并参与了生物体内一系列重要的生理活动,如肌肉收缩、细胞运动、胞质分裂等.这些过程的发生除了需要肌动蛋白以外,还需要一些与之结合的调节蛋白参与,cofilin就是其中一类低分子量的肌动蛋白结合蛋白,广泛分布于从酵母到哺乳类的生物体内.哺乳动物都表达两种cofilin基因：CFL1和CFL2,其中CFL2主要在骨骼肌和心肌表达,被认为是肌肉组织肌动蛋白装配的调节器,对正常肌肉功能和肌肉再生起着重要的作用.但目前对其研究还比较少,其在骨骼肌中的功能性作用尚未证实.本试验试图通过对猪肌肉组织CFL2基因结构及其蛋白功能的研究,进一步了解它在骨骼肌细胞生长发育中的作用,以便为后续多态性研究及今后猪的分子遗传育种提供理论基础.     

钼对小鼠骨骼肌上皮细胞氧化损伤及细胞骨架的影响

本试验旨在探究钼(Mo)对小鼠骨骼肌上皮细胞氧化损伤及细胞骨架的影响。试验以小鼠原代骨骼肌上皮细胞为材料,利用Mo浓度分别为0(Ⅰ组)、0.1(Ⅱ组)、0.2(Ⅲ组)、0.4(Ⅳ组)、0.8 mmol/L(Ⅴ组)的培养基对其进行细胞培养24 h。倒置显微镜观察细胞形态变化,四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞活力,比色法检测细胞抗氧化能力及氧化损伤,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western-blot)测定细胞骨架蛋白波形蛋白(Vimentin)、α-肌动蛋白(α-actin)、β-肌动蛋白(β-actin)的mRNA和蛋白表达。结果显示:1)Ⅰ和Ⅱ组细胞形态正常,Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组细胞间隙增大,细胞肿大,且Ⅴ组细胞出现明显畸形。2)与Ⅰ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组的小鼠骨骼肌上皮细胞活力极显著下降(P0.01)。3)与Ⅰ组相比,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组小鼠骨骼肌上皮细胞的超氧化物歧化酶活性和总抗氧化能力均极显著下降(P0.01),丙二醛含量极显著升高(P0.01)。4)与Ⅰ组相比,Ⅱ和Ⅲ组小鼠骨骼肌上皮细胞中Vimentin、α-actin和β-actin的mRNA相对表达量显著升高(P0.05),Ⅴ组显著降低(P0.05);Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ组小鼠骨骼肌上皮细胞中Vimentin、α-actin和β-actin的蛋白相对表达量均显著降低(P0.05)。综上所述,小鼠骨骼肌上皮细胞在经过高浓度的Mo作用后,形态发生异常,出现畸形,细胞活力下降,细胞抗氧化能力会受到抑制从而导致了氧化损伤的加剧,同时还抑制了Vimentin、α-actin和β-actin的mRNA和蛋白的表达。     

Cofilin在癌细胞迁移中的作用与调控

Cofilin(丝切蛋白)是肌动蛋白解聚因子家族的重要成员,其磷酸化状态直接决定对丝状肌动蛋白的切割活性,从而在膜突的形成及细胞迁移中起到重要的作用,并且与癌症的转移密切相关.在多种癌症细胞中,Cofilin受到复杂的调控,尽管尚不能直接应用于癌症的治疗,但一些相关机制已经形成了体系,这些理论将在本文中详细阐述.     

绿色荧光蛋白在家蚕细胞中的表达

利用家蚕细胞质肌动蛋白基因（A3）启动子和NPV病毒即刻早期蛋白IE启动子在家蚕细胞中表达GFP，实验结果表明是可行与有效的。     

家蚕微孢子虫总蛋白两条大分子量主带的LC-MS/MS分析

为了深入认识家蚕微孢子虫高分子量蛋白的主要组成,我们采用LC-MS/MS技术鉴定分析玻璃珠破碎法提取的家蚕微孢子虫总蛋白中85kD以上两条主要蛋白带。我们从H1带(位于150～200kD之间)中成功鉴定出16个蛋白,包括极管蛋白3(PTP3)、极管蛋白2(PTP2)、真核蛋白翻译起始因子(eIF2C2)、延伸因子(EF1-alpha、EF2)、肌动蛋白(actin)等。这暗示两种结构蛋白PTP3与PTP2以及蛋白翻译延伸因子(EF1-alpha、EF2)与肌动蛋白(actin)可能各形成一个复合体。并且用SDS或β-巯基乙醇处理时,这两个复合物是稳定的,表明这些复合物的相互作用力不仅仅是通过二硫键。H2带(85～100kD)鉴定出主要集中在水解酶、蛋白合成与折叠、细胞结构、运动四个方面的20多个的蛋白。从两条蛋白带鉴定出PTP3与PTP2、三磷酸腺苷酶(ATPase)或过渡期内质网三磷酸腺苷酶(ATPase-TER94)、蛋白翻译因子(eIF2C、EF1-alpha、EF2)、HSP70、Actin、M1家族氨肽酶1(M1family aminopeptidase)6类蛋白。基于蛋白分子质量分析,暗示在家蚕微孢子虫中,这6类蛋白都可能是以复合体形式呈现的。研究结果丰富家蚕微孢子虫高分子量蛋白的数据,同时,为研究非二硫键间的蛋白互作提供了有价值的研究线索。     

家蚕中肠细胞与家蚕核型多角体病毒经口感染因子P74的互作蛋白筛选

家蚕核型多角体病毒(Bm NPV)包涵体衍生型病毒粒子(ODV)被家蚕幼虫食下后通过侵染中肠上皮细胞引发全身性感染,这个过程称为经口感染。已知有多种ODV囊膜蛋白在经口感染中发挥关键作用,被称为经口感染因子(PIF)。P74作为最早被鉴定的PIF,与ODV结合中肠上皮细胞有关。为了鉴定宿主家蚕中肠细胞中与P74互作的蛋白质,构建家蚕中肠酵母文库,并以P74作为诱饵进行酵母双杂交筛选。初步筛选到7种互作候选蛋白,分别为U3小核仁核糖核蛋白IMP3、60S核糖体蛋白L5、JAB-MPN结构域蛋白、细胞质肌动蛋白A3、35 k D蛋白酶、富半胱氨酸和组氨酸蛋白1-B和真核翻译起始因子1A。免疫共沉淀实验结果表明JAB-MPN结构域蛋白和P74之间存在强烈互作,该蛋白质可能是ODV结合中肠细胞的关键宿主因子。研究结果为进一步阐明Bm NPV经口感染的详细分子机制提供了新的线索。     

酶消化法分离培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞

试验旨在探讨胶原酶消化法分离并培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞(pul monary artery smooth muscle cell,PASMC)的方法。将1～7日龄雏鸡的肺动脉中膜剪成小于1 mm2的组织块,0.1%Ⅱ型胶原酶消化分离PASMC并进行原代培养和传代培养。倒置显微镜下观察培养细胞的形态,对培养细胞进行HE染色和光学显微镜观察,并采用抗α-肌动蛋白单克隆抗体(α-Smooth muscle actin)免疫组化染色法检测细胞胞浆内α-肌动蛋白的表达,用以鉴定所培养的细胞。结果表明,倒置显微镜下细胞为长梭形,呈典型的"峰—谷"状,未见明显异型细胞。α-actin胞浆染色阳性细胞数占总细胞数的97%以上。因此,胶原酶消化法可用于分离培养肉鸡PASMC,且有方法简单,成活细胞数多、传代周期短的特点,可用于肉鸡心血管疾病如肺动脉高压和肺血管重构的研究工作。     

MSTN基因对牛肌动蛋白细胞骨架调节通路的影响

为探究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究前期利用定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析野生型蒙古牛（MG.WT）和MSTN^+/-蒙古牛（MG.MSTN^+/-）腿臀肌肌肉组织中蛋白质水平和磷酸化修饰水平的差异变化,使用已建立的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,检测设计合成的MSTN siRNA （si-MSTN）干扰效果;采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测转染si-MSTN的增殖期（GM）和分化第3天（DM3）牛骨骼肌卫星细胞中肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因的mRNA和蛋白水平的表达变化,研究敲低MSTN表达对肌动蛋白细胞骨架调节通路的影响。结果显示,在MSTN^+/-蒙古牛肌肉组织中共鉴定到16个肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因表达丰度上调;转染si-MSTN细胞中的MSTN表达水平极显著降低（P<0.01）;在转染si-MSTN的GM期牛骨骼肌卫星细胞中,肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因ENAH、ACTN4和Cdc42的mRNA水平均显著升高（P<0.05）,PFN1、RhoA和ACTN4的蛋白水平均显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）;在转染si-MSTN的DM3牛骨骼肌卫星细胞中,ENAH、CFL1、SCIN和Cdc42基因mRNA水平均显著升高（P<0.05）,RhoA基因mRNA水平极显著升高（P<0.01）,PFN1和ACTN4的蛋白水平均显著升高（P<0.05）。结果表明,干扰MSTN可以促进肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因的表达,探明了MSTN可能通过介导肌动蛋白细胞骨架调节通路影响牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的分子机制,为进一步研究MSTN对牛成肌分化的调控机制提供参考。     

宿主细胞F-actin聚集在顶复门原虫入侵过程中的作用研究

病原入侵宿主细胞,由宿主细胞肌动蛋白(F-actin)聚集引起的细胞骨架重排起着极其重要的作用,本文主要就宿主细胞整合素介导的宿主细胞F-actin聚集重排在顶复门原虫入侵过程中的作用进行系统的阐述,对解析顶复门原虫的入侵机制及以此研制新型寄生虫病药物和疫苗具有非常重要的意义。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体研究进展

猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)主要是通过与宿主细胞表面的特异性受体结合,利用细胞的内吞作用而感染易感细胞。作者对猪繁殖与呼吸综合征病毒相关受体的研究进行了综述,迄今已报道了5种独立的但功能相关的受体:硫酸乙酰肝素、唾液酸黏附素、波形蛋白、CD163和非肌肉肌动蛋白ⅡA。对受体的功能特性进行研究,将为PRRSV的感染机理和病毒性疾病的预防和治疗具有重要的意义。     

流感病毒的核蛋白是一种多功能RNA结合蛋白

流感病毒核蛋白 (NP)的主要功能是使病毒基因组衣壳化 ,以便 RNA转录、复制和病毒子装配。本综述的目的是说明 NP不仅是一种RNA结合的结构蛋白 ,而且作为病毒与宿主细胞之间的一种关键的配体分子而起作用 ,通过病毒和细胞的大分子之间相互作用来发挥其功能 ,包括 RNA、NP、病毒 RNA依赖的 RNA聚合酶和病毒基质蛋白。 NP也与细胞多肽相互作用 ,细胞多肽包括肌动蛋白、细胞核输入和输出装置所需的成分和细胞核 RNA解旋酶     

山羊皱胃平滑肌细胞的培养及鉴定

用外科手术方法取山羊皱胃的平滑肌组织,采用组织块培养的方法,在体外进行山羊皱胃平滑肌细胞的分离培养,为反刍动物皱胃疾病的研究提供了实验材料。结果表明,本研究成功培养出山羊皱胃的平滑肌细胞。倒置显微镜下,细胞生长状态良好,呈现平滑肌细胞特征性的"峰-谷"状结构,活细胞达95%以上,免疫组化染色显示细胞浆内平滑肌肌动蛋白呈阳性表达。     

细胞信号转导和骨架在人源福氏志贺菌侵袭鸡肠上皮原代细胞中的作用

为研究细胞信号转导和骨架在人源福氏志贺菌侵袭鸡肠上皮原代细胞中的作用,分别用酪氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白磷酸酶、蛋白激酶C、Ca2+通道等信号转导抑制剂染料木黄酮、原钒酸钠、星状孢子素、硝苯地平和微丝蛋白聚合抑制剂细胞松弛素B处理鸡肠上皮原代细胞后,采用细胞免疫组织化学染色检测人源福氏志贺菌ZD02株对鸡肠上皮原代细胞侵袭率,用间接免疫荧光双重标记检测ZD02株侵袭鸡肠上皮原代细胞后F-肌动蛋白分布的变化。结果显示,染料木黄酮、硝苯地平和细胞松弛素B能显著抑制人源福氏志贺菌ZD02株内化,星状孢子素和原钒酸钠对ZD02株的内化无影响,人源福氏志贺菌侵袭鸡肠上皮原代细胞时F-肌动蛋白发生聚集。本研究表明人源福氏志贺菌ZD02株侵袭鸡肠上皮原代细胞过程中需要酪氨酸蛋白激酶、Ca2+通道活化以及细胞微丝重排。     

紫花苜蓿肌动蛋白基因的提取

选取紫花苜蓿叶片为材料,提取总RNA,利用蒺藜状苜蓿的肌动蛋白基因设计特异性引物,扩增出目的基因的cDNA进行测序,测序结果在NCBI基因库中利用Blast与其他高等植物肌动蛋白基因序列进行了比对、分析,结果证明所提取的基因为紫花苜蓿肌动蛋白基因的片段。     

肉雏鸡肝细胞谷胱甘肽过氧化物酶mRNA表达产物的RT—PCR检测

细胞谷胱甘肽过氧化物酶（cGPX)是动物体内一种重要的抗氧化酶。建立了利用RT－PCR并以β－肌动蛋白（β-Actin)为内参照定量cGPX mRNA表达的方法。提取肉鸡肝总RNA，经反转录和PCR扩增，PCR产物的电泳条带于VDS摄像系统扫描灰度。寻求PCR线性扩增范围，确定PT－PCR的的最佳循环次数和模板量。通过计算cGPX PCR产物与β-肌动蛋白PCR产物的灰度之比，即可得出cGPX mRNA的相对含量。     

奶牛皱胃平滑肌细胞体外培养方法的建立

平滑肌细胞是胃动力的基本单位,为研究奶牛皱胃弛缓的发病机理,本研究建立了奶牛皱胃平滑肌细胞的体外培养方法。手术取奶牛皱胃组织,镜下分离出肌层,运用酶消化法分离皱胃平滑肌细胞并进行体外培养,在倒置显微镜下观察细胞的生长状态,用免疫组化染色方法进行平滑肌细胞鉴定。结果显示细胞生长状态良好,呈现平滑肌细胞特征性的"峰-谷"状结构,免疫组化染色显示细胞浆内平滑肌肌动蛋白呈阳性表达,表明该细胞为平滑肌细胞,可用于后续的试验研究。     

不同内吞方式中的关键因子抗体对树突状细胞捕获猪细小病毒样颗粒的影响

为了探明猪脾树突状细胞(DC)捕获猪细小病毒样颗粒的方式,通过磁性筛选的方法从猪的脾分离DC,DC与肌动蛋白抗体小窝蛋白caveolin-1抗体、猪IgG受体FcγRI(CD64)的抗体及DEC205抗体分别在37℃下作用1h后,再与荧光素FITC标记的猪细小病毒样颗粒(FITC-PPV-VLPs-E290)在37℃下作用1h,应用流式细胞仪及共聚焦显微镜检测体外DC对FITC-PPV-VLPs-E290的捕获情况。结果显示,经肌动蛋白抗体处理的DC几乎不能捕获FITC-PPV-VLPs-E290,经caveolin-1抗体处理的DC对PPV-VLPs-E290的捕获效率明显下降。而CD64及DEC205抗体则对DC的捕获效率无影响,表明DC对PPV-VLPs-E290的捕获依赖于肌动蛋白,与巨胞饮、小窝蛋白介导的内吞方式有关,而与吞噬作用及DEC205依赖的网格蛋白介导的方式无关。     

CFL2基因研究进展

CFL2基因是肌动蛋白结合蛋白家族的重要成员,研究发现,CFL2基因主要在哺乳动物的骨骼肌和心肌中表达,在肌肉组织肌原纤维发生和解聚过程中调节肌动蛋白的转换,对维持肌肉正常的生长发育和功能起着非常重要的作用。文章总结了CFL2基因结构、表达特性及其在细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭以及家畜经济性状(生长性状和肉质性状)中的重要作用,以期为进一步提高家畜养殖的经济效益以及育种改良寻求有效途径。     

G蛋白偶联受体及G蛋白在细胞信息传导中的作用

G蛋白介导的信号传导系统是细胞中最常见的信号传递方式。G蛋白偶联的信号传导系统由G蛋白偶联受体、G蛋白和效应器组成。1977年Ross和Gilman证实G蛋白可作为细胞受体与效应器之间的转换器。大量研究发现,G蛋白偶联信号传导系统普遍存在于动植物中。主要阐述了G蛋白和GPCRs在细胞传导中的作用。