猪DNA甲基转移酶基因家族进化分析

【目的】 探究猪DNA甲基转移酶（DNMT）基因家族的基因特性及表达模式。【方法】 利用生物信息学方法鉴定猪全基因组范围的DNMT基因家族，并对其染色体定位、理化性质、蛋白质结构、亚细胞定位、基因结构、保守基序、系统进化关系、共线性关系和基因表达模式进行分析。【结果】 共鉴定得到5个猪DNMT基因家族成员：PigDNMT1、PigDNMT2、PigDNMT3、PigDNMT4和PigDNMT5，分别位于2、3、13、14、17号染色体上。猪DNMT基因家族进化树分析发现，PigDNMT1和PigDNMT4、PigDNMT2和PigDNMT5的亲缘关系较近。PigDNMT2和PigDNMT5具有相同数量和排列顺序的保守基序，但在基因结构上差异较大。系统进化树结果揭示，猪、人、小鼠和牛的DNMT基因家族分为4个亚族，其中猪与牛的DNMT基因家族亲缘关系更近。基因共线性分析显示，猪与人、小鼠、牛之间都具有4对直系同源DNMT基因，表明4个物种的DNMT基因间存在较强的共线性关系。猪DNMT家族蛋白长度在228~1 706个氨基酸之间，分子质量在26 133.32~192 267.80 u之间，等电点在6.00~9.06之间。二级结构预测分析结果显示，猪DNMT蛋白主要由无规则卷曲组成。亚细胞定位分析发现，5个猪DNMT蛋白定位于细胞核。母猪性腺轴的转录组数据分析发现，PigDNMT1在下丘脑、垂体和卵巢组织中随着初情启动过程而展现出不同的表达模式。【结论】 本研究在猪基因组上共鉴定出5个DNMT基因，并发现性腺轴组织中的PigDNMT1在初情启动过程中呈现出不同的表达模式，为解析猪DNMT基因家族功能提供一些参考。     

黑果枸杞GRF转录因子家族鉴定与生物信息学分析

为探究黑果枸杞（Lycium ruthenicum） GRF基因家族成员在盐胁迫下的耐盐分子机制，采用生物信息学方法，对黑果枸杞转录组数据库进行分析，并对GRF家族成员的理化性质、保守结构域、进化树、基因家族表达谱进行分析。结果表明，通过转录组数据共筛选出14个GRF家族成员，这些蛋白编码氨基酸的个数为136~585 aa，等电点为5.58~9.33，分子量为14.566 97~62.986 65 kDa。保守基序表明，多数黑果枸杞GRF的N端具有QLQ和WRC保守结构域。系统进化分析发现，14个LrGRFs被分为7个亚族，位于同一亚族的GRF基序组成相似，部分黑果枸杞GRF与番茄GRF具有相对应的进化关系。表达谱表明，不同组织的LrGRFs在不同盐胁迫下均有响应，其中LrGRF6，LrGRF10和LrGRF12在根中高表达，而LrGRF2，LrGRF6和LrGRF10在叶中表现为高表达，这表明其可能在黑果枸杞中发挥着更加重要的调控作用。结果为进一步深入揭示LrGRFs在盐胁迫环境下的分子机制奠定了理论基础。     

水牛ABCD基因家族生物信息学分析及ABCD1基因表达研究

为鉴定水牛ATP结合盒（ATP-binding cassette,ABC）转运蛋白D （ABCD）基因家族成员及其在水牛中的表达,本研究利用生物信息学对水牛ABCD基因家族的染色体定位、基因结构、保守结构域、蛋白理化性质进行分析,利用实时荧光定量PCR检测ABCD1基因在水牛各组织及不同泌乳期乳腺中的表达,并用3种激素处理水牛乳腺上皮细胞,检测激素对ABCD1基因表达的影响。结果显示,从水牛全基因组中共鉴定出9个ABCD家族基因,分别为ABCD1、ABCD2、ABCD3、ABCD4,其中ABCD4基因包含6个不同转录本（ABCD4X1-ABCD4X6）,ABCD1~ABCD4 4个基因分别位于X、4、6、11号染色体;序列分析发现,ABCD家族基因包含9~22个内含子,编码444~741个氨基酸,分子质量为49.63~83.41 ku,等电点为6.43~9.64;共找到ABC_membrane_2、Endonuclease_5、ABC_tran 3个ABCD家族基因所共有的功能基序。ABCD基因家族可分为4个亚族,系统进化树显示,ABCD基因高度保守。共线性分析表明,水牛和奶牛之间存在7对直系同源的ABCD家族基因。不同组织定量表达结果表明,ABCD1基因在水牛15个组织中均有表达,其中在脂肪组织中表达量最高。不同泌乳时期的乳腺组织定量表达结果显示,ABCD1基因在50 d表达量达到最高,整个泌乳期呈现低-高-低表达模式。用不同浓度催乳素、雌二醇、孕酮分别处理水牛乳腺细胞,当催乳素、雌二醇和孕酮浓度分别达到2.0、0.3和4.5 μg/mL以上时,ABCD1基因表达量显著高于对照组。结果表明,水牛ABCD基因家族包含9个基因,其中ABCD1基因参与泌乳调控,本研究为进一步探讨ABCD家族基因在水牛乳腺中的功能提供了参考依据。     

昆明犬IGF2基因克隆、生物信息学分析及其时空表达研究

【目的】 克隆昆明犬胰岛素样生长因子2（IGF2）基因并研究其序列特征及时空表达规律,为工作犬体型及生长发育相关研究提供基础资料。【方法】 采用PCR法扩增昆明犬IGF2基因CDS区,运用生物信息学分析预测昆明犬IGF2蛋白的结构与功能;利用实时荧光定量PCR技术检测IGF2基因在2.5月龄昆明犬心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏及大腿内侧肌肉和不同年龄段肝脏中的表达情况。【结果】 昆明犬IGF2基因CDS区全长717 bp,编码238个氨基酸;系统进化树分析显示,昆明犬IGF2基因与赤狐的遗传距离最近,与鸡的遗传距离最远。生物信息学分析表明,IGF2蛋白分子质量为26.46 ku,理论等电点为9.61,无信号肽和跨膜结构,属于亲水性非分泌蛋白;主要分布于细胞核（47.8%）和线粒体（17.4%）,存在23个磷酸化位点;该蛋白的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,三级结构与二级结构预测结果相符。组织表达谱分析显示,IGF2基因在2.5月龄昆明犬肝脏中相对表达量最高,且极显著高于肾脏、肺脏及肌肉组织（P<0.01）;仔犬期（2.5月龄）肝脏中的IGF2基因的表达量极显著高于幼犬期（6月龄）、青年期（1岁）及成年期（1.7和2.5岁）（P<0.01）。【结论】 本研究成功克隆昆明犬IGF2基因,并发现IGF2在多个组织广泛表达,在肝脏中的表达量最高,可为深入探讨昆明犬IGF2基因在生长发育中的调控机理提供参考。     

Identification of CAX gene family and expression profile analysis of response to abiotic stress in alfalfa北大核心CSCD

Ca²⁺/H⁺反向转运蛋白（CAX）是一类重要的跨膜转运蛋白,在调控植物Ca²⁺平衡、抵抗非生物胁迫和转运重金属离子等方面具有重要作用。利用生物信息学方法在全基因组水平对紫花苜蓿CAX基因家族进行了鉴定,并对其理化性质、结构特征、系统进化关系、顺式作用元件、染色体定位等进行了分析。结果表明,在紫花苜蓿全基因组中共筛选鉴定出15个MsCAX基因,分布于紫花苜蓿15条染色体上,发生22对基因片段重复事件,编码367~460个氨基酸,等电点为5.2~6.5,且均表现为疏水性蛋白。系统进化关系分析结果表明,MsCAXs分为2个亚家族,同一亚家族成员具有相似的基因结构、保守基序和跨膜结构域数量。MsCAXs启动子区域存在光响应性、激素反应性和胁迫响应元件。利用qRT-PCR分析了6个MsCAXs基因在非生物胁迫下的表达模式,结果表明,在干旱和低温胁迫下,6个MsCAX基因均显著下调表达,在盐和盐碱胁迫下,3个MsCAX基因上调表达。说明在不同的非生物胁迫下,MsCAXs基因表现出不同的表达模式。研究结果为进一步探索紫花苜蓿CAX基因家族的功能提供了参考。     

柑橘几丁质酶基因家族的结构、分类与进化分析

【目的】植物的几丁质酶与其抗病能力、防御反应和生长发育密切相关，本文通过生物信息学方法来研究柑橘几丁质酶基因家族成员的性质。【方法】通过检索柑橘全基因组序列，发现了32个几丁质酶基因，使用生物信息学软件对这些基因进行分子量、等电点、信号肽、细胞定位、转录谱、保守结构域、系统发育树等方面进行研究。【结果】该家族基因中有26个成员定位在染色体上，其余6个位置尚未确定。这些几丁质酶基因家族成员的蛋白分子量、氨基酸残基和等电点分别位于14.8～72.7KDa、134～636个和4.53～9.21之间。。除3个预测蛋白不含信号肽外，其余均含有信号肽，其中23个蛋白定位在细胞外，6个蛋白横跨细胞膜。对这些基因在花、叶、果实和愈伤等组织的转录组测序数据进行分析，发现它们的转录水平相差巨大，有的在几种组织中转录水平都很高，有的在不同组织中转录水平相差很大，有的在所有组织中表达量都很低。用最大似然法对蛋白序列构建系统发育树，结合保守结构域的分析结果，可将这些几丁质酶基因分为4类。第1类有信号肽且定位在细胞外，有GH18几丁质酶结构域，同时具有糖基水解酶的功能；第2类大部分是带信号肽的跨膜蛋白，也有GH18几丁质酶结构域，还有一个丝氨酸/苏氨酸激酶的结构域；第3类带信号肽且定位在细胞外，有GH19几丁质酶结构域，同时具有溶菌酶的活性；第4类仅有一个基因，是个无信号肽的跨膜蛋白，有GH18几丁质酶结构域，同时具有糖基水解酶的功能，除此之外还含有抗病蛋白中常见的PPR重复结构域。【结论】对柑橘几丁质酶家族进行分析，有助于了解几丁质酶抗病的分子机制，找出起主效抗病作用的几丁质酶基因，从而为提高柑橘的抗病育种提供帮助。     

猪SGK家族基因的生物信息学分析及其在猪脂肪组织和细胞中的表达

【目的】 扩增猪血清和糖皮质激素诱导型激酶（SGK）家族基因并进行生物信息学分析,探索其在猪脂肪组织和细胞中的表达模式。【方法】 以藏猪脂肪细胞cDNA为模板PCR扩增SGK家族基因,通过在线工具预测其编码蛋白的理化性质及亚细胞定位;用Mega X软件构建系统进化树;采集30日龄巴马猪心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、背肌、腿肌、颈部脂肪、背部脂肪、腹股沟脂肪、肾周脂肪等组织及7日龄和4月龄猪腹股沟脂肪组织,通过实时荧光定量PCR检测SGK家族基因在猪不同部位组织中的表达;采集30日龄巴马猪腹股沟脂肪组织并分离基质血管成分（SVF）细胞,诱导SVF细胞向白色脂肪细胞分化,通过实时荧光定量PCR检测SGK家族基因及脂肪分化标记基因CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）、过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）在脂肪细胞中的表达。【结果】 SGK1、SGK2和SGK3基因CDS区序列长度分别为1 296、1 104和1 473 bp,分别编码431、367和490个氨基酸;SGK1和SGK2定位于细胞质,SGK3定位于细胞核,三者均为亲水性蛋白,3个蛋白均含有相同基序,保守性高;系统进化树结果表明,猪与牛的亲缘关系最近;SGK1和SGK3基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、多种肌肉及脂肪组织广泛表达,SGK2基因在颈部、背部、腹股沟、肾周脂肪组织中均有较高表达;SGK1和SGK2基因在7日龄猪脂肪组织中表达量极显著高于4月龄猪脂肪组织（P<0.01）,SGK3基因在4月龄和7日龄的猪脂肪组织中表达量无显著差异（P>0.05）,且SGK3基因的表达量低于SGK1和SGK2基因;与未分化脂肪细胞相比,在分化后的脂肪细胞中SGK1和SGK2基因的表达量极显著上调（P<0.01）,且SGK1基因的表达量远高于SGK2基因,而SGK3基因的表达量无显著变化（P>0.05）。【结论】 SGK家族蛋白具有保守结构域,可能发挥着相似的功能,SGK1和SGK2可能参与调控猪脂肪细胞的分化过程,结果可为探究猪脂肪沉积的分子机制提供一定的理论基础。     

猪TRIM3基因克隆、生物信息学及组织表达分析

【目的】克隆大白猪三基序结合蛋白3（tripartite motif-containing 3,TRIM3）基因,并对其进行生物信息学和组织表达分析。【方法】采用PCR技术扩增并克隆大白猪TRIM3基因CDS全长序列,连接pMD18-T载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,通过蓝白斑筛选阳性克隆,菌液PCR鉴定后测序,与不同物种TRIM3基因序列比对并构建系统进化树;应用多种在线软件对其编码蛋白进行生物信息学分析,并利用实时荧光定量PCR方法检测TRIM3基因在大白猪不同组织中的相对表达量。【结果】大白猪TRIM3基因CDS序列全长2 235 bp,编码744个氨基酸。相似性和遗传进化分析结果显示,大白猪与野猪的相似性最高,达99.7%,与鸭的相似性最低,为75.1%;大白猪TRIM3基因与野猪先聚为一类,与牛和山羊亲缘关系较近。生物信息学分析显示,大白猪TRIM3蛋白分子质量为80.58 ku,理论等电点（pI）为8.32,不稳定系数为40.85,为亲水性蛋白,但不是分泌蛋白,无糖基化位点,预测其有60个磷酸化位点,主要存在于细胞质内;在TRIM3蛋白二级结构中以无规则卷曲为主,占41.67%,三级结构模型预测结果与二级结构一致。组织表达分析表明,大白猪TRIM3基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、气管、结肠中均有分布,肺脏中表达量最多且显著高于其他组织（P＜0.05）。【结论】本研究成功克隆大白猪TRIM3基因CDS全长序列,并进行了生物信息学和组织表达分析,为进一步研究大白猪TRIM3蛋白的免疫学功能提供理论依据,对探究大白猪TRIM3基因参与先天性免疫和抗病毒感染分子机制具有重要意义。     

谷子RNA干扰相关酶类基因家族的鉴定与分析

Dicers酶类、Argonautes蛋白以及RNA依赖的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerases,RDRs)是RNA干扰(RNA interference,RNAi)机制中重要的核心蛋白,但在谷子(Setaria italica)中尚无系统报道.为了研究谷子中与RNA干扰相关酶类基因的特征,本研究对谷子的RNA干扰相关酶类基因家族进行了蛋白质理化性质、亚细胞定位预测、蛋白质保守基序、基因保守结构域、基因家族成员间系统发育关系以及组织特异性表达谱分析.研究共发现24个与谷子RNA干扰相关酶类基因,包括7个DCL(Dicers),13个AGO(Argonautes),4个RDRs.系统进化树分析表明,这些家族被分为3个进化支.同一家族基因成员具有共同的保守结构域.虽然大多数基因可同时在不同发育时期的叶、茎和穗中表达,但其在各时期的穗和茎中的表达量最高.本研究为详细探讨这些基因在谷子生殖和生长发育中的表观遗传修饰作用提供了理论依据.     

猪DDX家族成员基因结构与表达特性分析

为了系统研究DDX解旋酶家族成员在猪生长发育中的作用，试验采用生物信息学方法和实时荧光定量PCR检验技术，对猪DDX家族的42个成员的基因结构、理化性质、功能结构域、聚类进化树、GO功能，以及在大白猪和马身猪盲肠组织中的表达情况进行了研究。结果表明：猪DDX家族除DDX28和DDX53基因没有内含子外，其他成员均含有外显子和内含子，且外显子平均数量为16个，内含子平均数量为15个。除8号染色体外，其他染色体上均有猪DDX家族成员分布。该家族成员均为疏水蛋白并且大多数不稳定，具有多个亚细胞定位，整体来看主要分布于细胞核中。猪DDX家族成员共预测到了15个保守基序，其中DDX1、DDX11、DDX19B、DDX26、DDX36、DDX39A、DDX58和DDX60基因缺失D-E-A-D保守基序，有10个保守基序出现在超过30个成员的序列中，同时不同成员有相同的基序类型和特定的基序排列顺序。聚类分析将猪DDX家族42个成员分为6大簇，其中DDX2和DDX48、DDX21和DDX50、DDX43和DDX53、DDX5和DDX17具有高度同源性，支持率为100%。该家族大多数成员具有ATP依赖性...     

猪MORC2基因克隆、生物信息学分析及组织表达定位

【目的】克隆猪的Microrchidia家族CW锌指蛋白2（Microrchidia family CW-type zinc finger 2,MORC2）基因,利用生物信息学手段分析其序列特征,并检测MORC2基因在猪不同组织中的表达情况和卵巢中的定位。【方法】以猪卵巢cDNA为模板扩增和克隆MORC2基因完整CDS区,并进行相似性比对及系统发育树构建;利用生物信息学软件对猪MORC2蛋白序列进行预测;使用实时荧光定量PCR检测MORC2基因在猪不同组织中的表达情况;利用免疫组化方法检测猪MORC2蛋白在猪卵巢中的定位情况。【结果】猪MORC2基因CDS区序列全长3 102 bp,编码1 033个氨基酸。猪MORC2蛋白氨基酸序列与人、黑猩猩、恒河猴、小鼠、牛、绵羊、鸡和斑马鱼的相似性分别为94.8%、94.6%、94.9%、91.9%、93.8%、93.9%、80.8%和64.3%。系统进化树表明,猪与灵长类亲缘关系最近,与反刍动物和啮齿类次之,与斑马鱼（鱼类）亲缘关系最远。猪MORC2蛋白分子质量为117.44 ku,理论等电点为8.16,半衰期为30 h,属于不稳定蛋白。MORC2蛋白的平均疏水性为―0.736,为亲水性蛋白,不含跨膜结构和信号肽。猪MORC2蛋白有174个磷酸化位点、81个糖基化位点;亚细胞定位属于核蛋白,细胞质次之,线粒体中有少量表达;含有经典的MORC蛋白家族结构：GHKL-ATPase、zf-CW和CC结构域。组织表达谱结果显示,MORC2基因在猪各组织中广泛表达,其中在肝脏中表达量最多,显著高于其他组织（P＜0.05）,在心脏、肺脏和肌肉中表达量较少,显著低于其他组织（P＜0.05）。免疫组化结果显示,MORC2蛋白在健康猪卵泡颗粒细胞和膜细胞中均有表达且表达量较高,在闭锁的卵泡颗粒细胞和膜细胞中表达量较少。【结论】试验成功获得猪MORC2基因完整CDS区序列,该基因在猪各组织中广泛表达,MORC2蛋白主要在健康猪的卵泡颗粒细胞和膜细胞中表达。研究结果为进一步研究MORC2蛋白调控猪卵巢发育和卵泡闭锁的分子机制提供理论依据。     

大长杂交猪DJ-1基因克隆、生物信息学及表达分析

【目的】克隆大长杂交猪DJ-1基因CDS区并进行生物信息学分析,探讨DJ-1基因在猪脂肪组织中的表达规律,为后续探究该基因在猪脂肪沉积中的功能奠定基础。【方法】以大长杂交猪腹股沟皮下脂肪组织cDNA为模板,PCR扩增DJ-1基因CDS区,利用在线工具对DJ-1蛋白进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR检测DJ-1基因在大长杂交猪、大白猪（瘦肉型猪）和莱芜猪（脂肪型猪）脂肪组织中的表达量,并比较表达差异。【结果】大长杂交猪DJ-1基因CDS区全长570 bp,编码189个氨基酸。系统进化树分析表明,大长杂交猪和牛亲缘关系最近,与斑马鱼亲缘关系最远。DJ-1蛋白分子质量为19.94 ku,是一种稳定的酸性、亲水性蛋白,且含有1个GAT_1超家族成员Thij结构域;无信号肽和跨膜结构域,具有21个磷酸化位点、4个N-糖基化修饰位点和1个O-糖基化修饰位点。DJ-1蛋白二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角、无规则卷曲组成,占比分别为42.86%、17.99%、7.94%和31.22%,三级结构预测结果与其一致。蛋白互作分析发现,DJ-1蛋白可能与SOD2、NDUFV2、SNCA、BCL2L1和MAP3K等蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR结果表明,DJ-1基因在大长杂交猪背膘、腹股沟脂肪和肾周脂肪组织中均有表达,但无显著差异（P>0.05）;且在大白猪脂肪组织中的表达量显著或极显著低于莱芜猪（P<0.05;P<0.01）。【结论】本研究成功克隆了大长杂交猪DJ-1基因CDS区,其编码蛋白属稳定的酸性、亲水性蛋白,在莱芜猪脂肪组织中的表达量显著或极显著高于大白猪。本试验结果为进一步研究猪DJ-1基因功能提供理论参考。     

水牛TRAIL基因克隆及生物信息学分析

【目的】对水牛肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)相关凋亡诱导配体(TNF-related apotosis-inducing ligand,TRAIL)基因CDS序列进行克隆及序列分析,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析,为后期TRAIL蛋白调控水牛卵巢卵泡发育、颗粒细胞增殖及凋亡的研究奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆水牛TRAIL基因CDS序列,对所获序列进行核苷酸序列、氨基酸序列相似性比对,构建系统进化树,并通过生物信息学软件分析TRAIL基因编码蛋白的结构和功能。【结果】试验成功克隆水牛TRAIL基因CDS序列,长864 bp,编码287个氨基酸;水牛TRAIL基因与牦牛、普通牛、山羊、绵羊、野猪、马、人、黑猩猩和家鼠的核苷酸序列相似性分别为99.2%、99.3%、95.9%、96.3%、84.7%、84.8%、81.3%、81.3%和70.0%。系统进化树结果表明,水牛与牦牛、普通牛的亲缘关系最近,与家鼠亲缘关系最远。氨基酸序列比对结果表明,在不同物种间,其跨膜结构域和TNF结构域序列保守性较高。TRAIL蛋白属于亲水性蛋白,存在1个跨膜结构域,140―285位氨基酸处为TNF区,具有29个磷酸化位点,无信号肽和糖基化位点,主要定位于细胞质中。TRAIL蛋白二级结构主要以无规则卷曲为主,约占51.57%,其次为延伸链(24.39%)和α-螺旋(24.04%)。TRAIL蛋白三级结构与二级结构一致,且与模型蛋白人TRAIL蛋白的相似性为75.53%。【结论】本试验克隆得到水牛TRAIL基因CDS区序列,大小为864 bp,编码287个氨基酸,水牛与牦牛、普通牛亲缘关系最近,TRAIL蛋白跨膜结构域和TNF结构域在不同物种间序列保守性较高,这可能与其功能有关。     

鸡Wnt基因家族生物信息学分析及表达

【目的】试验旨在对鸡Wnt基因家族进行全面系统地调查分析,并进一步明确鸡感染新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)后Wnt基因家族成员的表达模式。【方法】基于鸡基因组测序结果,通过查询Pfam和UniPort数据库获取鸡Wnt基因家族全基因组序列,构建系统进化树,分析Wnt蛋白理化性质、亚细胞蛋白定位、染色体分布、保守结构域等,并进一步研究鸡感染NDV后Wnt基因家族成员的表达模式。【结果】试验共鉴定到39个鸡Wnt基因家族成员。系统进化树分析发现,鸡与人和鼠的Wnt成员相似性较高,均有12个亚家族,即Wnt1、Wnt2(Wnt2a和Wnt2b)、Wnt3a、Wnt4、Wnt5(Wnt5a和Wnt5b)、Wnt6、Wnt7(Wnt7a和Wnt7b)、Wnt8(Wnt8a和Wnt8b)、Wnt9(Wnt9a和Wnt9b)、Wnt10a、Wnt11及Wnt16成员,但鸡缺少Wnt10b。鸡Wnt成员分布于11条染色体上,分别为Chr1、Chr2、Chr4、Chr6、Chr7、Chr12、Chr13、Chr21、Chr26、Chr27和Chr34,成员间出现1...     

肠炎沙门菌avrA蛋白的原核表达及其生物信息学分析

【目的】 表达具有生物学活性的肠炎沙门菌（Salmonella Enteritidis） avrA蛋白,并对其进行生物信息学分析,为研究肠炎沙门菌avrA蛋白对猪肠道细胞免疫功能的影响提供参考。【方法】 根据GenBank中肠炎沙门菌avrA蛋白全基因序列（基因ID：1254388）设计引物扩增avrA基因,回收的目的片段与表达载体pGEX-4T-1进行重组、克隆,用限制性内切酶和基因测序验证重组表达质粒的正确性。将验证后的重组表达质粒转化大肠杆菌Rosetta 2（DE3）感受态细胞,并在不同条件下对重组表达菌进行诱导表达。应用SDS-PAGE和Western blotting检测avrA蛋白的表达情况。将酶切测序后目的基因序列进行BLAST比对分析,并用ExPASy-Translate Tool软件预测avrA蛋白的氨基酸组成。应用生物信息学软件预测avrA蛋白的跨膜结构域、二级结构、三级结构及抗原性。【结果】 肠炎沙门菌avrA基因CDS序列全长为909 bp,编码302个氨基酸。限制性内切酶及基因测序分析结果表明,重组表达质粒pGEX-4T-1-avrA构建成功。SDS-PAGE和Western-blotting结果表明,重组菌所表达的avrA蛋白为可溶性蛋白。重组菌在15 ℃诱导16 h表达的蛋白量为10 mg/L,蛋白溶解度为40%。生物信息学分析表明,avrA蛋白为膜外蛋白,该蛋白的16―301位氨基酸具有来自超家族YopJ丝氨酸/苏氨酸乙酰转移酶的保守结构域;avrA蛋白二级结构中无规则卷曲、α-螺旋、延伸链分别占43.71%、39.40%和16.89%;avrA蛋白三级结构预测结果与二级结构一致;avrA蛋白有9个与B细胞结合的抗原表位,分别在第5―40、51―68、80―92、94、101―109、146―157、160―168、199―231和236―298位氨基酸处。【结论】 试验成功克隆出肠炎沙门菌avrA基因,并成功构建重组表达质粒和表达菌,诱导表达的avrA蛋白为可溶性表达;avrA蛋白为膜外蛋白,有9个能与B细胞结合的抗原表位。本研究结果为进一步制备检测肠炎沙门菌感染的抗体提供参考。     

麝鼠香腺Elovl1基因生物信息学分析及表达研究

【目的】 测定麝鼠超长链脂肪酸延伸酶1(elongase of verylong chain fatty acid 1,Elovl1)基因序列并进行生物信息学分析,探讨其在麝鼠香腺发育和泌香过程中的作用。【方法】 使用TRIzol法提取成年雄性麝鼠香腺总RNA,采用转录组测序技术获得麝鼠香腺Elovl1基因序列并测序;在GenBank数据库中下载啮齿目不同物种的Elovl1基因及其多转录本CDS序列并构建系统进化树;通过在线工具对Elovl1基因编码蛋白的理化性质及结构进行预测与分析;利用实时荧光定量PCR技术分析成年雄性麝鼠香腺发育周期内香腺组织中Elovl1基因的表达水平。【结果】 Elovl1基因在麝鼠香腺中表达2个转录本,能编码2个不同的蛋白,分别由313和279个氨基酸组成。Elovl1基因2个转录本在2~9月末的麝鼠香腺中均有表达,且表达量整体呈先上升后下降的趋势。Elovl1基因编码的2个蛋白均为稳定的亲脂性、非分泌蛋白,具有7个跨膜螺旋区,亚细胞定位均主要位于内质网。在啮齿目动物中,Elovl1基因进化与物种进化基本一致,仓鼠科与鼠科亲缘关系较近,麝鼠与水鼠平亲缘关系最近;同一物种Elovl1基因的不同转录本间相对保守,均按物种聚在一起且置信值普遍较高,旱獭例外。【结论】 Elovl1基因表达规律与麝鼠香腺的发育、萎缩及泌香周期相吻合,提示Elovl1与麝鼠香分泌相关,并参与了香腺细胞发育。     

白来航鸡半乳糖凝集素-1基因克隆、生物信息学及组织表达特性分析

【目的】克隆白来航鸡半乳糖凝集素-1(galectin-1,Gal-1)基因,对其编码蛋白进行生物信息学分析,并检测其在不同组织中的表达情况,为进一步阐明其抗病毒功能提供科学依据。【方法】以鸡脾脏cDNA为模板,通过PCR扩增鸡Gal-1基因完整CDS区序列,并进行相似性比对及系统进化树构建;运用生物信息学软件对其编码蛋白的理化性质、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、修饰结构、保守结构域及高级结构进行预测。利用实时荧光定量PCR检测Gal-1基因在白来航鸡心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑、腺胃、肌胃、十二指肠、空肠、盲肠、直肠、胸肌和腿肌组织中的表达情况。【结果】白来航鸡Gal-1基因CDS区序列长度为408 bp,编码135个氨基酸。相似性比对结果表明,白来航鸡Gal-1基因核苷酸序列与火鸡、绿头鸭和珍珠鸟的相似性分别为97.1%、88.4%和82.2%;系统进化树结果表明,白来航鸡与火鸡亲缘关系最近。Gal-1蛋白分子质量为15.06 ku,理论等电点为6.57,不稳定系数为36.05,脂肪系数为74.30,平均亲水指数为-0.259。Gal-1蛋白无信号肽,不存在跨膜区;存在2个明显的亲水区,其编码蛋白较稳定,为亲水性蛋白。二级结构预测显示,Gal-1蛋白以无规则卷曲(45.93%)和延伸链(41.48%)为主,三级结构预测结果与二级结构一致。实时荧光定量PCR结果显示,Gal-1基因mRNA在白来航鸡组织中广泛表达,在肺脏中表达量最高,在脑中表达最低。【结论】本研究成功克隆了白来航鸡Gal-1基因CDS区序列,Gal-1基因在白来航鸡心脏、肝脏等14种组织中广泛表达,结果可为鸡Gal-1蛋白功能的深入研究提供参考。     

多浪羊CNP基因克隆及其在初情期组织表达特性分析

【目的】 克隆多浪羊C型利钠肽(CNP)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在多浪羊初情期启动前后下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中的表达规律,以期为研究CNP基因在多浪羊初情期启动过程中的作用机制提供参考。【方法】 参考GeneBank中绵羊CNP基因的序列(登录号:XM_027974523.1)设计引物,以初情期前、初情期、初情期后的多浪羊为试验对象,采用RT-PCR技术扩增多浪羊CNP基因并进行克隆测序;用DNAMAN软件同其他物种进行相似性比对,并使用Mega 5.0构建系统发育树。用生物信息学软件分析CNP基因的核苷酸序列及其编码蛋白的疏水性、信号肽、磷酸化位点、跨膜结构域等理化性质和二级结构、三级结构信息;用实时荧光定量PCR技术检测多浪羊下丘脑、垂体、输卵管、卵巢、子宫中CNP基因的表达量。【结果】 多浪羊CNP基因序列大小为2 227 bp,其中包括5'-UTR 50 bp、3'-UTR 914 bp和CDS区1 263 bp。相似性比对和系统发育树结果显示,多浪羊与山羊的亲缘关系最近,与鸡的亲缘关系最远;多浪羊CNP基因共编码420个氨基酸,其编码蛋白是亲水性蛋白质,无跨膜结构域和信号肽。多浪羊CNP蛋白的二级结构主要是α-螺旋和无规则卷曲;三级结构预测显示CNP蛋白无配体结构;实时荧光定量PCR结果显示,在初情期启动的3个发育阶段,下丘脑中CNP基因表达量显著高于其他组织(P<0.05);初情期下丘脑中CNP基因的表达量显著低于初情期前(P<0.05);子宫中初情期前CNP基因的表达量显著高于初情期和初情期后(P<0.05)。【结论】 本研究成功克隆了多浪羊CNP基因,其主要在下丘脑和子宫中表达;在初情期前、初情期、初情期后的发育过程中,下丘脑组织中CNP基因的表达量先降低再升高,提示CNP基因可能在初情期的启动过程中参与调控。