抗大肠埃希氏菌粘附素单克隆抗体诊断试剂的研制及其现场初步应用

作者从所研制的抗产肠毒素性大肠埃希氏菌(ETEC)粘附素K_(88)、K_(99)、987P和F_(41)单克隆抗体(以下简称单抗)44株中的7株,建立了检测以上粘附素抗原的单抗诊断试剂,并确定了以4单抗和3单抗夹心ELISA为特征的检测大批量临床样品的诊断方法与程序,对1038例自然发生下痢仔猪粪样ETEC粘附素的检测结果表明,本试验所建立的诊断方法与程序,具有敏感、准确、快速和简便的特点。     

单抗-间接ELISA检测犊牛腹泻粪样的牛冠状病毒

应用自制的牛冠状病毒(BCV)单抗兔抗BCV高免血清及进口辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG建立了间接ELISA,用以检测BCV抗原。在所检的44份犊牛腹泻粪样中,30份为阳性.同时用供常规诊断使用的国外同类单抗作比较检测,两者符合率达89.6%,尤其是抗原效价高的样本,更加吻合。阳性和阴性对照的OD值稳定,可重复性好,已知轮状病毒粪样为阴性.证明自制的BCV单抗确实可靠,以其建立的间接ELISA达到了临床检测实用的国际水平.     

大肠杆菌定居因子K_(88)抗原ELISA检测法

本文报告用ELISA双抗体夹心法检测大肠杆菌定居因子K_(88)抗原。K_(88)大质粒转化子和K_(88)基因重组子。结果说明此法灵敏度较高,特异性较好,可直接检测菌液,有快速、简便的优点,可以作为检测k_(88)基因克隆是否表达的一种筛选方法,亦可考应虑用于大肠杆菌k_(88)菌株的检测。     

A型流感病毒NP蛋白双单抗夹心ELISA检测方法的建立

为建立广谱型A型流感病毒(IAV)快速检测方法,本研究选用流感病毒中高度保守的核糖核蛋白(NP)为抗原,采用真核表达系统纯化NP蛋白,并免疫小鼠,按常规方法制备IAV NP蛋白单克隆抗体(MAb)。以制备的SC06 MAb作为捕获抗体,XJ04 MAb作为检测抗体,经条件优化,建立了检测IAV NP蛋白的双单抗夹心ELISA方法。结果显示,该检测方法捕获抗体浓度为2 mg/mL,0.1μg/孔,检测抗体浓度为1 mg/mL,0.05μg/孔,NP蛋白浓度在6.07 ng/mL～101.57 ng/mL时与OD_(450nm)呈良好的线性关系,相关系数R~20.99。该双单抗夹心ELISA方法可以特异性检测多个亚型IAV,特异性强;与血凝试验相比,该双单抗夹心ELISA方法具有很高的灵敏度,可以检测到20 ng/mL的病毒NP蛋白;批内和批间重复性变异系数均小于8%,重复性好。利用本研究建立的双单抗夹心ELISA方法与RT-PCR方法同时对28份马鼻拭子样品进行检测,结果显示二者总符合率为71.43%。本研究建立的ELISA方法可以用于甲型流感的快速诊断,也可为NP蛋白功能研究及定量检测提供技术支持。     

基于单抗捕获牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原ELISA方法的建立及应用

应用制备的牛病毒性腹泻病毒(BVDV) CC13B毒株E2蛋白的单克隆抗体与多克隆抗体,建立了基于单抗捕获牛病毒性腹泻-黏膜病病毒(Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,BVD-MDV)抗原的双抗体夹心ELISA方法。方阵试验确定的捕获BVDV抗原的单克隆抗体最佳抗体包被量为200 ng/孔,酶标多克隆抗体的最佳稀释浓度为1 000倍稀释。对100份BVDV阴性粪便样品进行检测与统计学处理,确定了夹心ELISA检测BVDV抗原的判定标准为待检样品D₄₉₀值≥0.156 7时,检测结果判定为阳性。特异性、敏感性和重复性试验结果显示,建立的检测BVDV抗原的方法具有特异、敏感、快速及重复性好等特点。以建立的单抗捕获BVDV抗原的夹心ELISA方法,调查了山东、河南和吉林3省部分地区牛群BVDV感染情况,发现上述地区牛群的BVDV感染率低至6%。本研究结果为BVDV感染的诊断、检疫、净化及防制提供了有效的技术手段及流行病学理论依据。     

鹅细小病毒单抗双夹心ELISA检测方法的建立

为建立鹅细小病毒(GPV)检测方法,本研究以兔抗GPV IgG为捕获抗体,抗GPV单克隆抗体为检测抗体,通过方阵试验确定了兔抗GPV IgG最适包被浓度为16 mg/L,抗GPV单克隆抗体最佳工作浓度为10.8 mg/L,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4 000,建立了检测GPV单抗双夹心ELISA方法,对GPV检测灵敏度达0.312 mg/L.用该法对延边某养鹅场疑似发生小鹅瘟病的252只病死鹅进行检测,结果阳性率为75.79%,与病毒中和试验方法的检测结果符合率迭91.11%.本研究建立的单抗双夹心ELISA方法为GPV的检测和区城流行病学调查提供了一种简便快速的血清学诊断方法.     

猪水肿毒素单抗竞争ELISA试剂盒的研制及应用

本研究旨在建立猪水肿毒素抗体的快速检测方法.以纯化的猪水肿毒素A亚基基因片段的原核表达产物作为抗原免疫BALB/c小鼠制备单抗,并利用表达蛋白和猪水肿毒素A亚基单抗酶结合物建立了竞争ELISA方法检测猪水肿毒索抗体.经过研究确定抗原包被浓度为0.32 btg·mL-1,待检血清最佳稀释度为1:2,酶标单抗工作浓度为1:3 200,血清抑制率大于40 %为阳性.应用单抗竞争ELISA和细胞毒性中和试验同时对60份血清进行猪水肿毒素抗体检测,竞争ELISA的检出率为33.8%,细胞毒性中和试验检出率为30.9%,两者符合率达88.2 %.试验结果表明,该ELISA方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性好,操作简便.本方法的建立在实验室诊断的标准化、猪水肿病疫苗免疫效果的评价及流行病学调查方面具有较高的应用价值.     

胃蛋白酶原Ⅱ单抗制备及夹心ELISA的初步建立

制备配对胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ)单抗,建立人血清中胃蛋白酶原Ⅱ夹心ELISA检测方法。用胃蛋白酶原Ⅱ免疫Balb/c小鼠,制备免疫脾细胞,与SP2/0融合,用HAT培养基进行筛选培养,间接ELISA检测阳性克隆,对阳性孔进行多次单克隆化,选出效价高、分泌性能稳定的杂交瘤细胞,制备腹水并进行纯化。进行单抗配对,建立胃蛋白酶原Ⅱ双抗体夹心检测方法。获得1D8、1C6、2H11、2E3等4株杂交瘤,经配对试验,确定1D8、2H11可作为夹心ELISA检测PGⅡ的单抗。成功制备出配对单抗,初步建立了PGⅡ双抗体夹心ELISA方法。     

单抗竞争ELISA检测猪沙门氏菌感染方法的建立与应用

以猪霍乱沙门氏菌作为包被抗原 ,利用沙门氏菌O7单克隆抗体酶结合物建立了竞争ELISA方法检测猪霍乱沙门氏菌抗体。经过研究确定抗原包被浓度为 2×1 0 8CFU/ml,血清检测稀释度为 1∶1 6,酶标抗体浓度为 1∶70 0 ,包被液为碳酸盐缓冲液 ( 0 .0 5MpH9.6)。应用单抗竞争ELISA和平板凝集试验 (PAT)同时对 5 0 6份血清进行猪霍乱抗体检测 ,PAT的检出率为 3 .60 % ,ELISA检出率为 5 .75 % ,两者符合率达 96.4%。试验结果表明 ,ELISA方法敏感性高 ,特异性强 ,稳定性和重复性好 ,操作简便。本方法的建立在猪群沙门氏菌感染的检疫、实验室诊断的标准化及流行病学调查方面具有应用价值。     

H-Y单抗检测方法初探

优化间接ELISA条件 ,提高灵敏度 ,建立检测H Y抗体的检测方法。利用BALB/c公鼠免疫同系母鼠 ,制备H Y单抗。PCR验证间接免疫荧光法鉴定胚胎性别准确率。结果表明 :鉴定雄性胚胎的准确率为 83% ( 1 5 / 1 8)。鉴定雌性胚胎的准确率为 94 % ( 1 5 / 1 6)。     

单抗捕捉ELISA检测猪附红细胞体血清抗体方法的建立

在制备针对猪附红细胞体病的特异性单克隆抗体的基础上,建立了单抗捕捉快速检测猪附红细胞体病抗体的ELISA方法,并对影响ELISA结果的各项反应条件进行了优化.结果表明,猪附红细胞体腹水单抗的最佳稀释度为1:20 000,猪附红细胞体病抗原工作质量浓度为4.088 mg/L,血清稀释度为1:40,HRP标记的兔抗猪IgG的工作浓度为1:5 000.待检血清和酶标二抗的反应时间均为37℃1 h;底物在室温显色时间为10 min.已建立的ELISA方法与PCR平行检测50份样本,总符合率为92%,表明该方法特异性强、快速、敏感性高.用该法检测了各地采集的171份血清,阳性率为40.4%,与镜检的符合率为59.2%;阴性率为47.4%,与镜检的符合率为66.7%,总符合率为67.3%.     

单抗竞争EILSA试验及其在鸡白痢病检疫中的应用

应用针对沙门氏菌 O_9抗原的单抗3-47-26酶结合物和鸡白痢沙门氏菌脂多糖抗原建立了一种单抗竞争 ELISA试验,以检测鸡白痢抗体.试验结果表明,79份鸡白痢阳性血清具有显著抑制作用,而130份鸡白痢阴性血清以及48份 SPF 鸡血清抑制不明显.对94份种鸡血清的检疫结果表明,单抗竞争 ELISA 比 PAT、AGPD、PHA 特异性好、敏感性高,文中进一步讨论了该法的应用前景.     

志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位单抗的制备

将表达志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位重组蛋白的菌株ppSLT-ⅡeA在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达重组蛋白.用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化重组蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为A2-D3,制备的单抗腹水ELISA效价为24log2,免疫印迹结果表明此单抗仅与重组蛋白反应,而与载体蛋白不反应.利用此单抗检测13株水肿病菌株,发现均产志贺样毒素Ⅱ型变异体.     

单抗-ELISA一步法检测兔粪样中的轮状病毒

用单抗２Ｂ４包被ＥＬＩＳＡ微孔反应板，将处理后的粪样和酶标兔抗ＬａＲＶＩｇＧ同时加入包被孔内孵育，置微型振荡器上振摇，建立了检测粪样中兔轮状病毒（ＬａＲＶ）抗原的单抗－ＥＬＩＳＡ一步法快速诊断技术，与常规ＥＬＳＩＡ、病毒分离培养、电镜、荧光抗体等作了实验室和临床应用比较，结果证明单抗－ＥＬＩＳＡ一步法敏感、特异、快速、简便、适于基层临床推广应用     

肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素单克隆抗体的制备及鉴定

以基因重组技术构建工程菌株表达肠出血性大肠杆菌O157:H7紧密素的融合蛋白。用纯化的紧密素蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,对杂交瘤细胞及时筛选,阳性孔经4次有限稀释法克隆,成功获得2株能稳定传代并分泌抗紧密素单克隆抗体(McAb)的杂交瘤细胞株。2株单抗分别制备腹水,ELISA检测效价分别为5.2×104,2.5×104。Western blot检测表明,2株单抗与融合蛋白发生特异性反应;ELISA检测表明,2株单抗可特异性检出大肠杆菌O157:H7。本研究为建立大肠杆菌O157检测方法提供了物质基础。     

牛病毒性腹泻病毒单克隆抗体捕获ELISA方法的建立

以纯化的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)作为抗原免疫BALB/C系小鼠,通过细胞融合和克隆筛选出稳定分泌BVDV抗体的杂交瘤细胞株,将杂交瘤细胞接种于BALB/C系小鼠的腹腔内诱生腹水,腹水单抗与BVDV均呈阳性反应.将5A9、2G3和5C2(分别结合不同的抗原结合位点)诱生的BVDV单抗纯化后等量混合包被酶标板,与鸡抗BVDV IgY(检测抗体)联合应用,建立BVDV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法.采用方阵滴定法确定单抗、鸡抗BVDV IgY的最适工作浓度,用阴性组织样品作为判定检测结果的D490临界值,最后以建立的AC-ELISA检测临床粪样棉拭子27份,结果表明:该方法敏感性、特异性高,与全血病毒分离结果的符合率迭86.36%;与全血和粪样RT-PCR检测结果的符合率分别为89.47%和94.74%.阴性对照RT-PCR、病毒分离和AC-ELISA检测均为阴性.     

伪狂犬病病毒gB蛋白单抗的制备及其夹心ELISA检测方法的建立

应用PCR技术扩增出伪狂犬病病毒(PRV)gB基因,并将克隆的目的片段连接到表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-B。以表达纯化的gB重组蛋白为抗原,制备单克隆抗体和兔源多克隆抗体,并以制备的抗体建立检测PRV抗原的双抗体夹心ELISA方法,同时对吉林省某地区猪群感染PRV的情况进行流行病学调查。结果显示,试验成功制备PRV gB蛋白单抗并建立其夹心ELISA检测方法。流行病学调查发现,PRV在吉林省某地区猪群的平均感染率为9.3%,且妊娠母猪阳性率高达11.7%,该结果为伪狂犬病的防治提供了理论依据。结果表明,本研究建立的双抗体夹心ELISA方法具有特异、敏感、简便与快速等优点,可用于PRV抗原的快速检测,为今后该病的诊断和流行病学调查研究提供技术手段。     

志贺样毒素II型变异体A亚单位单抗的制备

将表达志贺样毒素II型变异体A亚单位重组蛋白的菌株ppSLT -IIeA在含氨苄青霉素的 2×YTA培养基中培养 ,至对数生长期时加入IPTG诱导 ,诱导的重组菌超声波裂解后 ,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达重组蛋白。用谷胱苷肽活化的Sepharose 4B亲和层析柱纯化重组蛋白 ,测定纯化蛋白的浓度 ,免疫BALB/c小鼠 ,细胞融合后经ELISA检测 ,得到一株阳性杂交瘤细胞 ,命名为A2 _D3 ,制备的单抗腹水ELISA效价为 2 4log2 ,免疫印迹结果表明此单抗仅与重组蛋白反应 ,而与载体蛋白不反应。利用此单抗检测 13株水肿病菌株 ,发现均产志贺样毒素II型变异体     

单抗—ELISA一步法检测兔粪样中的轮状病毒

用单抗２Ｂ４包被ＥＬＩＳＡ微孔反应板，将处理后的粪样和酶标兔抗ＬａＲＶＩｇＧ同时加入包被孔内孵育，置微型振荡器上振摇，建立了检测粪样中兔轮状病毒抗原的单抗－ＥＬＩＳＡ一步法快速诊断技术，与常规ＥＬＩＳＡ，病毒分离培养，电镜，荧光抗体等作了实验室和临床应用比较，结果证明单抗－ＥＬＩＳＡ－一步法第三特异，快速，简便１，适于基层临床推广应用。     

F107(F18ab)菌毛单抗的制备、鉴定与初步应用

将大肠杆菌107／86和水肿病菌株在TSB中培养，鉴定其表达F107菌毛，前者作为免疫原免疫BABL／C小鼠，后者作为检测抗原包装酶标板。细胞融合后经ELISA和玻板凝集检测，得到一株阳性杂交瘤细胞株，命名为F7－1。该细胞株制备的腹水ELISA效价为：2^16，试管凝集价为：1：5120，在免疫印迹中可与提取的F107菌毛特异性条带发生反应。利用此单抗检测表明，91％的水肿病菌株表达F107菌毛。