绵羊肺腺瘤病毒受体透明质酸酶-2的原核表达及纯化

为建立绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)的原核高效表达体系,本试验设计了扩增JSRV受体Hyal-2基因的特异性引物,应用PCR技术扩增出Hyal-2全长基因,将该基因定向重组于原核表达载体pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1-Hyal-2重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,逐步优化条件至稳定表达,经Western blotting检测融合蛋白成功表达后,通过亲和层析法对融合蛋白进行纯化。结果表明,Hyal-2基因正确地插入到原核表达载体pGEX-4T-1中;经诱导含重组质粒pGEX-4T-1-Hyal-2的表达菌高效表达了带GST标签的目的蛋白;SDS-PAGE电泳结果显示目的蛋白分子质量为80 ku,与预期大小一致,经Western blotting验证为带GST标签的融合蛋白;通过谷胱甘肽亲和层析法获得纯化的目的蛋白。本试验结果为进一步制备Hyal-2蛋白的多克隆抗体及深入研究其功能奠定基础。     

辽宁绒山羊DLX3毛囊表达载体的构建及其转染成纤维细胞的研究

根据GenBank中已发表的DLX3基因(登录号:XM_005694267.1)序列设计引物,以辽宁绒山羊毛囊生长期皮肤组织cDNA为模板,采用RT-PCR方法,扩增出DLX3基因的CDS区,连接平末端载体并验证后与真核表达载体pIRES2-EGFP连接。真核表达载体经Xho Ⅰ和BamHⅠ双酶切鉴定后,通过脂质体法转染绒山羊耳源成纤维细胞,在荧光显微镜下观察细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达,并通过RT-PCR和Western blotting技术检测目的基因转录、蛋白质表达情况。结果表明,成功克隆了绒山羊DLX3基因,并构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-DLX3。重组质粒转染绒山羊成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下观察到绿色荧光,通过RT-PCR扩增909 bp的转录产物,并利用Western blotting检测到32.87 ku目的蛋白DLX3的表达。本试验结果为研究DLX3基因在绒山羊毛囊生长周期内的功能以及调控毛囊生长发育的机制奠定了基础。     

构建稳定表达JSRV受体Hyal-2小鼠肺上皮细胞系

为了构建稳定表达绵羊肺腺瘤病毒(JSRV)受体透明质酸酶-2(Hyal-2)蛋白的小鼠肺上皮细胞系,试验采用将重组质粒p DsRed-monomer-N1-Hyal-2转染小鼠肺上皮细胞后,用G418对转染后的细胞进行筛选、纯化,通过对不同培养代次的细胞系进行倒置荧光显微镜观察、RT-PCR、基因测序、Western-blot等方法加以验证。结果表明:试验成功构建了JSRV受体Hyal-2蛋白小鼠肺上皮细胞系,在传至20代后Hyal-2仍在该细胞系中稳定表达。说明该细胞系的成功建立,为研究绵羊Hyal-2对JSRV转化目的细胞能力的影响提供了一种体外试验平台。     

鸡BCL10基因的克隆与表达

通过电子克隆手段,克隆到大小为959bp的cDNA序列。然后从鸡的脾脏提取RNA,用RT-PCR方法扩增出目的片段。将该片段连接到原核表达载体pET-32a和真核表达载体pEGFP-C1中,采用SDS-PAGE检测原核表达载体pET-BCL10在大肠杆菌中的表达,脂质体转染法将真核表达载体pEGFP-BCL10转入vero细胞,Western blotting检测其在细胞中的表达。结果显示,PCR扩增到735bp的DNA片段,原核表达载体和真核表达载体经双酶切和核酸测序表明载体构建成功。SDS-PAGE电泳检测到pET-BCL10重组质粒在大肠杆菌中表达。Western blotting检测到pEGFP-BCL10重组质粒在vero细胞中表达。结论表明,BCL10基因在鸡体内存在,该基因的重组质粒能在大肠杆菌和vero细胞中表达。     

泛素化调节因子2真核表达质粒的构建及其在原代肾小管上皮细胞的表达

本试验旨在构建带有增强型绿色荧光蛋白报告基因EGFP及目的基因泛素化调节因子2(Smurf2)的真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,并转染小鼠肾小管上皮细胞检测其表达情况。用RT-PCR法扩增小鼠肾小管上皮细胞Smurf2的CDS区,构建克隆载体pEASY-Zero-Smurf2和真核表达载体pEGFP-N3-Smurf2,酶切并测序鉴定。运用脂质体转染法将pEGFP-N3-Smurf2真核表达载体转染小鼠肾小管上皮细胞,实时荧光定量PCR、免疫印迹检测Smurf2的表达。PCR结果显示扩增出Smurf2基因片段大小约为2247 bp;重组质粒pEGFP-N3-Smurf2的酶切鉴定及测序结果均表明Smurf2基因成功克隆到真核表达载体中;脂质体转染后检测结果显示,转染pEGFP-N3-Smurf2表达载体的肾小管上皮细胞中Smurf2基因mRNA表达量升高且EGFP-Smurf2重组蛋白有表达。本试验成功构建了含有增强型绿色荧光蛋白标记的Smurf2真核表达质粒,转染后能明显提高细胞内Smurf2的表达,为研究Smurf2基因的功能奠定了基础。     

新孢子虫SAG1-SRS2融合基因真核表达质粒的构建及表达

根据犬新孢子虫NcSAG1-NcSRS2融合基因序列,设计了1对含有Kozak序列、终止密码子、BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点的引物,以含有NcSAG1-NcSRS2融合基因的质粒pGEX-tNcP43-P36为模板,经PCR扩增获得NcSAG1-NcSRS2融合基因片段,用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切该片段,回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSAG1-NcSRS2融合基因,将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3.1（＋）真核表达载体中,获得重组质粒pcNCSAG1-SRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶酶切分析和克隆片段序列测定、比较,证实了重组质粒的正确性。将构建好的真核表达质粒转染到COS-7细胞中进行瞬时表达,经免疫荧光检测,证实了该载体能在细胞内进行蛋白表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白在Marc-145细胞中的表达

针对PRRSV E基因设计1对带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以PRRSV CC-1株为模版进行RT-PCR扩增,获得带有酶切位点的目的片段插入pMD18-T载体,对阳性重组质粒进行测序鉴定。将阳性质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切,回收目的片段将其插入EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-N1中构建重组质粒pEGFP-N1-E,将重组质粒用脂质体转染Marc-145细胞,通过荧光显微镜观察显示,在转染后24h出现荧光,48h出现荧光高峰,筛选阳性细胞株,进行目的基因转录、Western blot检测目的蛋白的表达鉴定。结果表明：成功构建真核表达载体pEGFP-N1-E,建立了稳定表达的细胞株。为研究E蛋白如何与宿主细胞结合形成通道,PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒E蛋白在Marc-145细胞中的表达

针对PRRSV E基因设计1对带有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的引物,以PRRSV CC-1株为模版进行RT-PCR扩增,获得带有酶切位点的目的片段插入pMD18-T载体,对阳性重组质粒进行测序鉴定。将阳性质粒进行EcoRⅠ、SalⅠ双酶切,回收目的片段将其插入EcoRⅠ、SalⅠ双酶切的真核表达载体pEGFP-N1中构建重组质粒pEGFP-N1-E,将重组质粒用脂质体转染Marc-145细胞,通过荧光显微镜观察显示,在转染后24h出现荧光,48h出现荧光高峰,筛选阳性细胞株,进行目的基因转录、Western blot检测目的蛋白的表达鉴定。结果表明:成功构建真核表达载体pEGFP-N1-E,建立了稳定表达的细胞株。为研究E蛋白如何与宿主细胞结合形成通道,PRRSV吸附、穿入宿主细胞的作用机理以及筛选特效的粒子通道阻断剂奠定了基础。     

绵羊肺腺瘤病毒缺失型SU蛋白真核表达载体的构建

试验证明绵羊透明质酸酶2(hyaluronidase 2,Hyal-2)可以作为绵羊肺腺瘤病毒的受体与绵羊表面蛋白(surface protein,SU)亚基结合。为了进一步研究绵羊Hyal-2与SU蛋白可能结合的区域,运用生物信息学软件预测了SU蛋白的膜外区部分,然后分别构建了一系列缺失型真核表达载体,将缺失型SU蛋白真核表达载体pEGFP-C1-(su1~su5)转染293T细胞,激光共聚焦显微镜观察结果显示:SU1-SU5融合蛋白定位于细胞质,Western blot结果显示在66 000处出现阳性条带,表明成功构建了SU蛋白缺失型真核表达载体。     

乳铁蛋白基因启动子元件调控效应分析

本试验先后进行2轮载体构建及转染试验,对牛乳铁蛋白基因启动子元件调控效应进行了分析。首先进行第1轮载体构建及转染试验：采用PCR方法,利用4对引物从牛乳铁蛋白基因5′调控区-1 799向3′端依次缺失500bp进行调控序列扩增,将获得的扩增片段替换pEGFP-N1的CMV启动子,构建了4个重组载体,将重组载体转染牛乳腺上皮细胞（BMEC）,经筛选获得稳定的单克隆细胞,测定并比较各组细胞的荧光强度。在以上试验基础上,为进一步精确确定牛乳铁蛋白基因启动子顺式调控元件序列,进行第2轮载体构建及转染试验,方法同第1轮。结果表明,牛乳铁蛋白基因上游调控序列-1 323～-1 372存在负调控元件,-1 372～-1 560存在正调控元件。     

水牛髓样分化因子88融合蛋白真核表达载体的构建及其在HEK293细胞中的表达

将水牛髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)cDNA全长定向克隆至pEGFP-C1真核表达载体,通过酶切和测序鉴定正确后,经脂质体介导将重组质粒转染至HEK293细胞,应用荧光显微镜、流氏细胞术和Western blotting检测MyD88蛋白的表达。结果表明,酶切及测序结果证实重组质粒含有MyD88全长CDS序列,融合蛋白读码正确;荧光显微镜、流式细胞术和Western blotting检测证实,水牛EGFP-MyD88融合蛋白真核表达载体能够在HEK293细胞表达。本研究成功构建了pEGFP-C1-MyD88真核表达载体,并使其在HEK293细胞中获得表达,为进一步研究该基因的生物学功能奠定基础。     

牛乳腺β-酪蛋白基因的克隆及其表达载体的构建

利用高保真PCR法,分别扩增了牛乳腺β-酪蛋白基因的1.8和1.1 kb的5′和3′调控序列,将其分别克隆入TA载体。经PCR验证后测序,用NCBI Blast软件分析表明其克隆片断与奶牛β-酪蛋白基因相应区域同源性分别为97.0%和99.0%,表明成功克隆了酪蛋白基因5′和3′的调控区。然后利用DNA重组技术依次亚克隆入改造过的真核表达载体pcDNA3（切除CMV启动子）,构建成牛乳腺特异表达载体。获得的重组载体经限制性内切酶酶切鉴定,测序验证等表明,成功构建了牛乳腺特异表达载体。     

奶牛LAP基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的瞬时表达

根据GenBank上发表的牛舌抗菌肽(Lingual antimicrobial peptide,LAP)基因cDNA序列设计1对特异引物,从患乳腺炎的奶牛乳腺组织中以RT-PCR方法扩增LAP基因片段,将其克隆到pMD19-T Simple载体中测序。重组质粒经EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切回收目的基因片段,亚克隆入增强型绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1中构建重组融合表达质粒pEGFP-LAP,将其脂质体转染COS-7细胞,经荧光显微镜观察到融合表达的绿色荧光蛋白,采用RT-PCR检测到LAP基因在COS-7细胞中转录。pEGFP-LAP重组表达质粒的成功构建为进一步研究奶牛LAP基因的表达特性及利用基因工程技术防治奶牛乳腺炎奠定了基础。     

鸡α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ基因的克隆和真核表达载体的构建

试验利用Trizol法从鸡肠道组织提取总RNA,采用特异性引物通过RT-PCR扩增出α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(α-2,3-sialyltransferaseⅠ,ST3GALⅠ)基因的cDNA片段,并将其克隆至pGEM-T easy载体,获得阳性重组质粒,再以阳性重组质粒为模板亚克隆ST3GALⅠ基因的完整ORF区,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,进行PCR、限制性酶切和DNA序列分析鉴定。结果表明,ST3GALⅠ基因全长1029 bp,测序结果同GenBank数据库收录的序列一致,无任何密码子缺失与突变,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上的目的基因大小方向均正确。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ST3GALⅠ真核表达载体,为下一步的真核表达及对ST3GALⅠ基因的功能研究奠定了基础。     

猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒的构建及真核表达

为构建猪附红细胞体ENO基因重组腺病毒穿梭质粒,试验根据GenBank中登录的猪附红细胞体ENO基因序列（登录号：CP002525.1）设计特异性引物,对ENO基因进行PCR扩增,并将纯化后的PCR产物克隆到pMD19-T载体中。用Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ对pMD19T-ENO进行双酶切后,将其亚克隆至腺病毒穿梭载体PCR259中,构建PCR259-ENO重组质粒,提取重组质粒进行鉴定。应用脂质体介导转染法将鉴定正确的PCR259-ENO重组穿梭质粒转染293细胞,应用间接免疫荧光法（IFTA）检测ENO基因在293细胞中的表达。结果显示,试验克隆的ENO基因长为1 182 bp,编码393个氨基酸,与GenBank中ENO基因序列（登录号：CP002525.1）同源性为99%。构建的重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO经PCR和酶切鉴定正确,并且能在293细胞中表达,表明ENO基因成功插入腺病毒穿梭质粒PCR259中,重组腺病毒穿梭质粒PCR259-ENO构建成功。     

猪流行性腹泻病毒E基因真核表达载体的构建与鉴定

(目的)构建猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)E基因真核表达载体pCI-E,为探讨E基因的功能奠定基础。(方法)根据GenBank上已发表的PEDV CV777株序列,利用Primer5.0设计1对两端含限制性核酸内切酶EcoR I和Sal I酶切位点的特异引物,用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出完整的231bp的目的基因,将目的基因与pMD19-T载体连接转化到大肠杆菌DH5α中,用测序、PCR、双酶切鉴定阳性克隆体。然后将纯化后的E基因插入表达载体(pCI-neo)上,并经双酶切、测序鉴定。(结果)成功构建了PEDV的pCI-E重组真核表达载体。(结论)pCI-E重组真核表达载体的构建为进一步探讨PEDV E基因的功能和分子生物学特性及PED防御新途径提供依据。     

牛卵泡抑素基因克隆及真核表达载体构建

[目的]克隆牛的卵泡抑素基因（Follistatin,FSTN）基因,构建真核表达载体。[方法]用Trizol法从牛的卵巢中提取总RNA,反转录成cDNA,用带有酶切位点牛FSTN的特异性引物扩增其完整编码区序列,连接到T载体、测序,序列无误后亚克隆入真核表达载体pIRES2-AcGFP1中,酶切及PCR鉴定载体。[结...     

微量牛卵中H1foo CDS序列的克隆及其mRNA向卵内显微注射

本研究旨在优化从微量卵中克降基因的条件,并构建牛H1foo基因真核表达载体.首先将微量(1～5个)卵母细胞裂解后,用改进的RT-PCR方法扩增内参β-actin基因以检测该方法扩增基因的效率,结果表明单卵扩增成功率为80%以上(10/12),3个、5个卵扩增成功率均达100%.利用该体系从微量(5个)牛卵中克隆得到H1fooCDS全长序列,测序结果显示其与GenBank上公布序列同源性为100%.将牛H1foo CDS连接至pMD19-T载体上,经酶切、测序鉴定正确后定向亚克隆到真核表达载体pVenus上,鉴定正确后命名为pVenus-H1foo.利用脂质体2000将pVenus-H1foo转染Hela细胞,24 h后通过荧光显微镜观察、RT-PCR、Western Blotting分别检测表明其能够正确表达.将H1foo体外转录为mRNA后直接注射卵母细胞,其表达产物能准确定位于卵母细胞及极体的染色体上.结果,成功构建了牛H1foo真核表达载体pVenus-H1foo,为研究该基因在卵母细胞成熟及早期胚胎发育过程中的作用奠定了基础.