基于qPCR技术快速检测青枯劳尔氏菌5号生理小种的方法

由青枯劳尔氏菌(以下简称青枯菌)5号生理小种(Ralstonia solanacearum race 5)引起的桑青枯病是桑树的重大病害。采用荧光定量PCR(qPCR)技术对病原菌进行早期检测,为病害的预测预报及有效防控提供依据。从青枯菌差减基因文库筛选一对引物RS72F/RS312R,经PCR扩增试验及qPCR产物的熔解曲线分析验证其可特异性地扩增出青枯菌5号生理小种241 bp的基因片段。建立的qPCR标准曲线显示:以青枯菌5号生理小种基因组DNA为模板,在10-4~102 ng/μL范围内,DNA质量浓度的对数值与扩增Ct值呈现良好的线性关系,线性方程为y=-2.747x+21.834,R2=0.993;以青枯菌5号生理小种菌液为模板,在103~107 CFU/mL范围内,菌液浓度的对数值与扩增Ct值呈现良好的线性关系,线性方程为y=-3.418x+45.447,R2=0.998。应用建立的qPCR检测方法对经青枯菌5号生理小种菌液处理的土壤样品进行检测,结果显示可检测出自然环境中存在的低于致病浓度的病原青枯菌,且用菌液处理灭菌土壤和不灭菌土壤的样品间青枯菌检测的Ct值无显著差异。建立的检测方法具有特异性强、灵敏度高、可定量的特点,适用于由青枯菌5号生理小种引起的桑青枯病的早期检测诊断     

基于PMA-qPCR检测青枯菌5号生理小种活菌的方法

青枯菌5号生理小种(Ralstonia solanacearum race 5)是引发桑青枯病的病原菌。为了改进常规PCR方法不能对活体病原菌进行准确鉴别和定量分析的不足,建立叠氮溴化丙锭(PMA)预处理结合荧光定量PCR(q PCR)检测青枯菌5号生理小种活菌的方法。该方法首先将待检测样品的病原菌细胞用质量浓度为15 ng/μL的PMA暗孵育10 min后,在卤钨灯下曝光5min,以消除死菌细胞DNA的PCR扩增信号。用PMA-q PCR方法对含青枯菌5号生理小种活菌和死菌的混合样本的检测结果表明,死菌的存在不会对活菌细胞DNA的扩增产生影响。建立的PMA-q PCR标准曲线显示,在菌液浓度为103~107CFU/m L的范围内,qPCR循环阈值(Ct)与菌液浓度的对数值之间呈良好的线性关系,线性方程为y=-3.477x+47.489,R~2=0.997。建立的PMA-q PCR方法能更为准确地检测复杂样本中的青枯菌5号生理小种活菌数量,有助于对桑树青枯病的早期诊断和及时制定病害防控措施。     

浙江省蚕区桑树“凋萎”症状病因诊断

从浙江省临安、桐庐等地桑园中的"凋萎"桑树根、茎部获得151个细菌分离物样品。经离体水培接种试验表明,这些分离物均可引起桑树"凋萎"症状,其形态、大小、染色反应、培养性状与对照番茄青枯菌(Ralstonia so-lanacearum)相近;PCR鉴定其中125个分离物为雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。结合田间发生症状,将桑树"凋萎"症状诊断为细菌性青枯病。从125个雷尔氏菌株中选择16个典型菌株进行研究,根据生理小种划分标准,这些菌株均为雷尔氏菌的生理小种1,其中75%为青枯菌的生化型Ⅴ、25%为青枯菌的生化型Ⅲ。     

蜂胶渣提取物对青枯劳尔氏菌的抑制活性鉴定

青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是引发桑青枯病的病原细菌。为了寻求防治桑青枯病的天然药剂,以工业提取黄酮化合物剩余的蜂胶渣为原料,经甲醇、乙醇、乙酸乙酯、氯仿及石油醚等溶剂分级浸提获得除蜡蜂胶渣提取物。通过比浊法测试不同极性溶剂提取物对青枯劳尔氏菌5个生理小种菌株均有一定的抑制作用(抑菌率8.36%~99.73%),其中乙醇提取物的抑菌活性显著高于其他溶剂的提取物(P0.05)。0.1 mg/m L除蜡蜂胶渣乙醇提取物对青枯劳尔氏菌RS-5菌株的抑制率达91.61%±4.75%,最低抑菌浓度为0.25 mg/m L,最小杀菌浓度为4 mg/m L,用扫描电子显微镜观察到部分病原细菌发生变形和细胞壁破损,用平板法监测到菌体的泳动性能受到不同程度抑制。基于负离子全扫描模式的LC-MS谱图鉴定除蜡蜂胶渣中主要含有咖啡酸及其酯类化合物(包括咖啡酸丙酯、咖啡酸丁酯、咖啡酸苯乙酯及咖啡酸戊酯),采用选择性反应监测模式外标法检测出其中所含咖啡酸和咖啡酸苯乙酯的质量比为1∶3.3。研究结果表明,除蜡蜂胶渣的乙醇提取物对青枯劳尔氏菌具有良好的抑制活性,发挥抑菌活性的主要成分可能是咖啡酸及其酯类衍生物,该提取物有进一步开发为天然来源的桑青枯病防控药剂的潜力。     

4种桑树土传病原生防细菌的分离与鉴定

采用平板稀释法和平板抑菌圈法分离筛选对桑青枯病和桑枯萎病病原有拮抗作用的生防菌株,利用盆栽试验调查分离菌株对4种病原菌的防治效果,并结合形态学特征、生理生化特征及16S rDNA全长序列对菌株进行鉴定。结果筛选到一株对桑青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)、菠萝泛菌(Pantoea ananatis)4种桑树土传病原具有拮抗作用的菌株,平板抑菌圈直径分别为25 mm、30 mm、25 mm和15 mm;对应的盆栽试验的防治效果分别为714%、779%、750%和766%。根据形态特性、生理生化特征和rDNA全长序列,该菌株鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),命名为Pseudomonas aeruginosaYD001,这为桑树土传病害的防控研究奠定了基础。     

用于青枯劳尔氏菌快速检测的靶标内切葡聚糖酶抗体制备与检测试验

桑青枯病是一种土传性细菌病害,其病原为青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)。内切葡聚糖酶(EGL)是青枯劳尔氏菌在胞内合成后分泌、吸附于细胞壁周围的一个重要毒力因子,研究以其为靶标的桑青枯病快速检测诊断技术,可以为病害防控提供技术支持。从青枯劳尔氏菌G12-50菌株中克隆了egl基因,将青枯劳尔氏菌与土壤常见的4种细菌以及植物常见的4种病原细菌的内切葡聚糖酶进行氨基酸序列多重比对,其同源性较低。构建重组质粒p ET32a-EGL转化大肠杆菌BL21融合表达EGL蛋白,制备的抗EGL多克隆抗体经ELISA检测其效价达1∶20 000,Western blot分析亦呈现单一的特异性条带。用制备的抗体对培养的青枯劳尔氏菌G12-50菌液和感染桑青枯病的桑茎汁液进行Western blot检测,结果出现明显的特异性条带,而对照大肠杆菌则没有出现条带。研究结果表明,青枯劳尔氏菌的内切葡聚糖酶可以作为桑青枯病早期检测诊断的病原靶标,直接应用于对桑园土壤和桑树样品的快速检测。     

桑赤锈病菌干旱型生型小种的初步研究

从我国北方干旱地区采集的病原菌，经与南方普通型的病原菌进行致病性、侵染对湿度的适应性和菌丝侵入寄主组织的适存在等比较，发现该病夺菌属于桑锈孢锈力的干旱型生理小种，并提出用湖桑３２号、湖桑７号和黄鲁头等桑品种作为对桑锈孢锈菌生理小种的鉴别寄主。     

不同桑品种对桑青枯病抗性鉴定

通过疫区栽植、水培投菌、土壤浇菌等接种法,对50多个桑品种进行桑青枯病抗病性鉴定试验,调查结果表明了不同桑品种间对桑青枯病的抗性有明显差异。结果,白皮大种、真杜子桑、育2号、湖桑39等4个具有较高的抗病能力的桑品种可作为育种材料,并可在生产上利用。     

桑树青枯病的发生与防治研究进展

桑树青枯病是一种对桑树具有毁灭性的土传植物检疫性病害。上世纪70年代以来,业界对于桑青枯病的发病特点、发生途径、致病机制及防治措施进行了大量研究,并且取得了重要进展。本文主要综述我国桑树青枯病的研究概况,总结桑青枯病的发生规律、病原及致病机制,探讨桑青枯病的有效防治措施。     

化州县桑青枯病的为害情况与对策

我县是蚕桑新区,十多年来,桑青枯病的为害,严重影响了我县蚕桑生产发展的速度。一、化州县桑青枯病的为害情况桑青枯病在我县的为害,最早于一九七四年在合江区木襁塘村发生。近年来,桑青枯病在我县不断蔓延和扩展。一九一七八年,我县仅有7个区(公社),16个乡(大队)发生桑青枯病,现在已扩大到8个区,65个乡     

桑树病原原核生物及其病害的研究进展(Ⅱ)

前文报道了原核生物界薄壁菌门中引发桑疫病、桑青枯病、桑枝软腐病、桑枯萎病、桑叶斑病的病原细菌及其病害的研究进展。本文介绍原核生物界软壁菌门中引发桑萎缩病、桑皱褶花叶病和疵壁菌门中引发桑叶日灼病等的病原菌分类演变及其侵染循环,桑树发病规律与病害防治方面的主要研究进展,其中对桑萎缩病进行了重点介绍,内容涵盖国内外学者近一个世纪的研究成果。     

桑树病原原核生物及其病害的研究进展(Ⅰ)

侵染桑树的病原原核生物有细菌、菌原体、螺原体、立克次体等,其中由病原细菌引发的桑树细菌病害对蚕桑生产的危害极大。主要介绍原核生物界薄壁菌门的病原细菌侵染桑树导致的桑疫病、桑青枯病、桑枝软腐病、桑枯萎病和桑叶斑病等重要桑树细菌病害,从病原及其侵染循环,桑树发病规律、发病症状,病害防治方法几个方面概述其研究进展。     

桑树细菌性青枯病的研究概况

桑树细菌性青枯病是由青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种严重土传性病害,在我国华南蚕区桑园发病危害尤为严重。从病原菌的分类鉴定和检测技术、桑树的抗性鉴定方法及抗性种质资源评价等方面系统介绍了桑树细菌性青枯病的研究进展。针对现有研究存在的问题,提出今后应利用现代分子生物学技术深入研究桑树细菌性青枯病病原菌的致病机制以及桑树的抗性遗传规律,选育出具有高产优质性能的抗细菌性青枯病桑树新品种。     

几种常见桑树病害的识别与防治

桑树是蚕桑产业的重要物质基础。为确保桑树健康成长,促进产业发展,桑树病害的有效识别与及时防控尤为重要。真核微生物、原核微生物及非细胞类病毒中均存在能引发桑树传染性病害的病原微生物。其中由真核微生物引起的桑里白粉病与桑椹菌核病,原核微生物引起的桑青枯病与桑疫病是爆发频繁、危害极大的桑树病害。本文就这四种桑树病害的病原、侵染循环、病害识别及防治方法等进行系统梳理,并简要介绍几种非细胞类微生物引起的桑树病害,以期为生产上防治相关病害提供参考。     

桑树杂交组合抗青枯病能力鉴定及与抗病相关酶活性的研究

利用抗青枯病能力较强的桑树资源人工组配了24个杂交组合,并鉴定其抗病能力;对具有不同抗性水平的杂交组合的叶片过氧化物酶(POD)、多酚氧化物酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性进行比较分析。抗病能力鉴定结果表明,24个桑树杂交组合对青枯病的抗性存在明显差异,其中04-19×抗10和69×98-8为2个强抗组合。酶活性测定结果表明,桑树叶片中的POD活性与桑树杂交组合抗青枯病能力有密切关系,强抗性杂交组合的POD活性明显高于感病杂交组合。可将桑树叶片中的POD酶活性作为生化遗传标记之一,并结合常规抗病鉴定方法应用于桑树抗青枯病品种的杂交亲本选择。     

桑树芽条枯萎病病原研究 I.病原分离及致病性测定

笔者对陕西省安康地区桑园春季发生的一种梢条和嫩芽枯萎病害的病原作了初步研究,从感病材料各典型病部分离得到桑Ⅰ号菌和桑Ⅱ号菌,经LOPAT部分项目测定及常规致病性测定,究明桑Ⅰ号菌(丁香假单胞杆菌)为该病害主要致病细菌,桑Ⅱ号菌(草生欧氏杆菌)可以引起感染,其症状不如Ⅰ号菌典型,但两菌混合接种有加重病情的现象,故与本病害有密切的关系.     

桑黑枯型疫病综合防治技术研究

为了有效控制桑黑枯型疫病[Mulberry bacterial blight(black wilt type)]在江苏省盐城市蚕区的暴发危害,研究了对该病综合防治的影响因素和有效防治技术。通过单因子试验发现,夏伐迟早、施肥方式、稀释药剂的水质、施药前是否摘除有病芽叶等措施均显著影响对桑黑枯型疫病的综合防治效果;施药器械、施药方法对综合防治的效果影响不明显。在发病初期摘除有病芽叶后,喷施100 mg/kg盐酸环丙沙星或100 mg/kg盐酸恩诺沙星,配合其它农业措施,在盐城市3个蚕桑重点乡镇的4个中试点,均有效地控制了桑黑枯型疫病的发生与危害。关键词桑树;黑枯型疫病;综合防治;农艺措施     

桑叶颗粒剂对糖尿病的治疗作用研究

为研究桑叶颗粒剂主剂对糖尿病的治疗作用,以四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠为实验动物进行了疗效研究。饲喂含1％和5％桑叶颗粒剂主剂的饲料,调查小鼠的临床表现及血糖值,结果表明,桑叶颗粒剂主剂可改善糖尿病小鼠“多饮”和体重降低的症状,1％和5％的主剂剂量均可极显著降低血糖值(P<0.01),5％的主剂剂量组即使停药后仍保持显著的降糖效果(P<0.05)。因此,桑叶颗粒剂对糖尿病小鼠有显著治疗作用。     

家蚕人工饲料育用新品种选育研究

家蚕品种对人工饲料的适应性是制约人工饲料实用化的重要因素之一,在开发出低成本人工饲料后,经过定向选择育成了适应人工饲料育的蚕品种“西6 x 734”,其原种小蚕人工饲料大蚕桑叶育的饲育成绩与全龄桑叶育相当,且发育整齐,一代杂交种饲育成绩和缫丝成绩均达到桑叶育水平。