A型禽流感病毒通用型核酸检测标准样品的研制及不确定度分析

利用基因克隆和体外转录技术,制备A型禽流感病毒通用核酸检测阳性标准样品。根据禽流感基质蛋白基因M的序列,设计全长开放阅读框的克隆引物,RT-PCR获得相应片段,连接至pGEM-T载体,测序后采用体外转录方法制备RNA纯品,初步定量稀释后,混合分装作为核酸标准样品候选物。采用实时荧光定量RT-PCR方法进行均匀性和稳定性检验,并委托外部实验室采用外标实时定量RT-PCR方法对转录的RNA片段进行定值。通过绘制荧光定量标准扩增曲线和协作标定的方式,计算标准物质含量（拷贝）,并进行不确定度的估算。均一性结果显示瓶间差异小于5%,稳定性试验表明室温20~25℃（相对湿度20%~50%）14d,2~8℃3个月以及-20℃保存1年的含量均无明显变化。核酸标准物质定值为（3.120±0.345）×10^8拷贝数,可用作禽流感病毒通用核酸检测的标准质控品。     

新城疫病毒核酸检测标准物质研究

分别设计了3对引物,从灭活新城疫病毒F48E9株和Lasota疫苗株病毒提取的RNA中扩增了完整的M、FA和HN基因编码序列,并克隆于pGEM-T.经测序确认后,采用体外转录方法制备了6种RNA纯品.初步定量后,用RNA保存液稀释至含量约108拷贝数/mL,分装.分装后均一性检测结果显示瓶间差异<5%,稳定性实验表明室温20~25℃(相对湿度20%~50%)14天稳定;长期监测结果表明:2~8℃6个月及-20℃保存1年的含量均无明显变化.委托多家实验室采用外标实时荧光定量RT-PCR检测方法对制备的标准物质进行准确定值.以上结果表明该制备物可以作为新城疫病毒的核酸检测标准物质.     

病毒性出血性败血症病毒RNA标准物质的研制

利用基因克隆和体外转录技术制备病毒性出血性败血症病毒(VHSV)核酸检测标准物质。设计VHSV N基因的克隆引物,RT-PCR获得相应片段,连接至pGEM-T载体,测序后采用体外转录方法制备RNA纯品。初步定量稀释后,混合分装作为核酸标准物质候选物。采用核酸浓度测定与拷贝数换算的方法对转录的RNA片段进行定值。通过绘制荧光定量标准扩增曲线计算标准物质含量(拷贝数),并根据委托单位的定值结果进行不确定度的估算。均一性结果显示瓶间差异小于5%,稳定性试验表明室温20℃~25℃(相对湿度20%~25%)7 d,2℃~8℃保存1个月及-20℃保存6个月的含量均无明显变化。核酸标准物质定值为(6.625±0.149)×10~8copies/μL,可用作VHSV核酸检测的标准质控品。     

体外转录法制备西尼罗河热病毒RNA片段

目的通过体外转录获得西尼罗河热病毒保守区基因的RNA片段,为核酸快速检测方法的建立和改进提供阳性定量标准品。方法设计西尼罗河热病毒基因保守区克隆引物,PCR从合成的基因DNA获得相应片段,连接至质粒PGEM-T-easy上并筛选阳性重组质粒,测序鉴定后酶切线性化,用T7RNA聚合酶进行体外转录,得到固定长度的RNA片段,DNase酶处理后测定浓度,梯度稀释后用RT-PCR验证。结果获得含西尼罗河热病毒靶基因序列的准确定量拷贝数的RNA片段,质量浓度分别为352.6ng/μL,RT-PCR验证均扩增出相应目的条带。结论获得的RNA片段可作为西尼罗河热病毒核酸快速检测方法的阳性定量标准品。     

H7亚型禽流感病毒核酸标准品制备及双探针荧光RT-PCR检测研究

从禽流感病毒A/Chicken/1/2002(H7N1)核酸中扩增了完整HA的基因编码序列,克隆测序后,采用体外转录方法制备c RNA。用RNA保存液稀释至含量约108Copies/μL。分装后进行均匀性和稳定性检验,通过8家实验室联合定值,取平均值作为定值结果;经统计分析计算了该标准品的不确定度。此外,采用Taq Man方法,根据禽流感病毒H7亚型的血凝素基因的末端,采用1对引物和2条MGB探针,建立了禽流感病毒H7亚型Taq Man荧光RT-PCR快速检测技术。应用建立的方法对研制的标准品进行检测,检测限可达10基因拷贝;对新城疫病毒及其他亚型的流感病毒核酸进行检测,结果表明,建立的方法特异性良好,而且双探针的设计思路更能保证病毒核酸的有效检测,防止漏检。     

病毒性神经坏死病病毒核酸检测用标准物质的制备

利用基因克隆和体外转录技术,制备病毒性神经坏死病病毒(Nervous necrosis virus,NNV)核酸检测标准物质。设计NNV RNA2基因的特异性引物,通过RT-PCR获得目的片段并连接至p GEM-T载体;采用体外转录方法,获得大量纯品RNA。初步定量稀释至约10~8 copies/μL,均匀性检验结果显示样品间差异5%;稳定性检验表明,室温(20~25℃)保存7 d、冷藏(2~8℃)保存1个月和冷冻(-20℃)保存6个月的含量均无明显变化。采用核酸浓度测定与拷贝数换算的方法,对转录的RNA片段进行定值,并根据委托单位的定值结果进行不确定度估算。核酸标准物质定值为(8.452±0.068)×10~8 copies/μL,可用作NNV核酸检测的标准质控品。     

口蹄疫病毒WFL株基因组全长cDNA的克隆及序列分析

根据口蹄疫病毒基因组的结构特点以及GenBank上公布的全序列，用DNAMAN分别设计了涵盖整个基因组序列的3对引物，从接种口蹄疫病毒WFL株的细胞培养液中提取了病毒基因组RNA，采用RT-PCR方法和RACE法分别扩增了3条基因片段，并将扩增片段分别与T载体连接，在体外分别进行了5-半分子和3’半分子的构建。最后将5’半分子和3’半分子连接成基因组全长cDNA分子。经PCR鉴定、酶切鉴定及全长cDNA测序，证实成功构建了口蹄疫病毒wFL株基因组全长eDNA分子。序列分析结果表明，供试口蹄疫病毒基因组全长为8155nt，5＇UTR长1059nt；具有一个大的读码框，其核苷酸长度为6969nt。包括201aa的前导蛋白基因和2122aa的聚合蛋白基因；3＇UTR长127nt，包括34nt的polv（A）。     

口蹄疫病毒基因组结构及其功能

口蹄疫病毒的基因组结构和功能是开展口蹄疫其他研究如鉴别诊断、新型疫苗研制和疫源追踪等工作的基础。口蹄疫病毒的基因组由5′UTR、ORF和3′UTR及Po ly(A)组成,全长约8 500 nt。VPg可能充当RNA合成引物的作用, 5′UTR 内的Poly(C)和内部核糖体进入位点(internalribosomaentrysite, IRES)是当前研究的热点之一。Poly(C)可能与病毒的感染性有关,IRES 对翻译的起始有重要作用。一般认为Poly(A)越长,病毒的感染性越强。病毒的ORF包括P1、P2、P3基因。L、P2、P3研究的相对较少,其中3A与病毒的宿主嗜性有关,3D为RNA聚合酶,可作为免疫和自然感染动物的鉴别诊断抗原。P1 为口蹄疫病毒的抗原结构,是研究口蹄疫免疫机制和新型疫苗的基础。VP1 可以作为分子流行病学调查,被很多国家所采用。     

内含猪繁殖与呼吸综合征病毒保守基因序列假病毒粒子的构建及应用

为构建内含猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)保守基因序列的假病毒粒子,将MS2噬菌体基因组中5′非编码区、成熟酶蛋白基因、衣壳蛋白基因、包装位点和复制酶基因部分起始位点的cDNA序列克隆于原核表达载体pET32a,在其下游插入PRRSV ORF7和3′非编码区保守序列,获得重组表达载体pET-MS2-PRRSV。将重组质粒pET-MS2-PRRSV转化表达菌株BL21(DE3),经诱导表达、纯化,获得高纯度的病毒样颗粒。病毒样颗粒经RT-PCR和PCR鉴定含有PRRSV ORF7和3′非编码区RNA且没有质粒DNA残留,并能耐受RNase降解。采用荧光定量RT-PCR对病毒样颗粒定值后,制备了用于PRRSV核酸检测的标准品,该标准品模拟了真实病毒粒子的结构,无生物传染性,经检测均匀性和稳定性良好,可作为PRRSV核酸检测的阳性标准质控品,实现对核酸检测的全程监控。     

鸭病毒性肝炎研究概况

<正>1鸭病毒性肝炎病毒基因组特点鸭病毒性肝炎病毒(DHAV)有3个名称:鸭肝炎病毒、鸭星状病毒(DAstV)、鸭甲肝病毒。DHAV基因组的3个显著特点是:3′端(314～336nt)是小RNA病毒科中最长的;5′端内的结构元件有特点;2A由结构上不相关的蛋白组成,口蹄疫病毒样     

鸡新城疫云南分离株HN基因序列测定和分析

用RT—PCR法对分离自云南省的2株鸡新城疫病毒(编号YN—C1、YN—C2)进行HN基因的扩增和克隆．并对其进行核苷酸序列测定和分析。结果表明：2毒株HN基因开放性阅读框架(ORF)均为l716nt；二者之间的核苷酸同源性为95．3％，氨基酸同源性为95．8％；YN—C1毒株与参考毒株GD／1／98／Go核苷酸、氨基酸同源性均最高，分别为97．9％和97．6％；YN—C2毒株与参考毒株JS／5／01／Go核苷酸同源性最高为98．5％，而与参考毒株JS／3／98／Go氨基酸同源性最高为98．1%。     

PCR结合斑点杂交技术检测禽多瘤病毒方法的建立及应用

鹦鹉幼雏病是由禽类多瘤病毒(APV)引起的多种鹦鹉雏鸟死亡的急性病毒性传染病,严重危害鹦鹉养殖业的健康发展。为提高分子生物学方法检测APV的敏感性和特异性,对APV基因片段进行克隆和序列分析,设计合成1对特异性引物,以VP1基因为模板,经PCR扩增获得731 bp的核苷酸DNA,并用DIG标记,制备用于检测APV的特异性核酸探针;对制备的探针进行灵敏度检测,同时与普通PCR进行敏感性比较;使用制备的探针,对经分离鉴定和制备保存的其他7种禽病毒核酸进行特异性检测;用该核酸探针,对疑似感染APV的鹦鹉病料进行斑点杂交检测,并对鉴定为阳性的APV进行全基因组扩增和序列分析。结果显示:该探针可检测到2 pg量的APV特异性核酸片段;仅APV-VP1阳性核酸显色,呈现阳性反应,而阴性核酸和其他7种禽病毒核酸均不显色,呈阴性反应。结果表明:建立的核酸斑点杂交检测方法具有较高的灵敏度和特异性,可用于临床初步诊断。本方法的建立为我国开展APV分子流行病学调查及其感染的临床诊断提供了技术支撑。     

安徽地区IBDV超强毒株的分离鉴定和VP2基因序列分析

经鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)接种、易感鸡接种试验、电镜观察,从安徽地区疑似病鸡的法氏囊组织分离到3株传染性法氏囊病毒。分离株人工感染4周龄鸡,致死率分别为92%、83%、67%。接种9～10SPF鸡胚测得的鸡胚半数致死量(ELD50)分别为10-6.8/0.2mL、10-5.4/0.2mL、10-4.6/0.2mL。应用Nested-PCR分别对3株分离株VP2基因高变区进行克隆测序和序列分析,结果表明:3个分离株与国内外参考超强毒株的核苷酸同源性为97.2%～99.5%,氨基酸同源性为99.3%～100%,VP2高变区核苷酸和推导的氨基酸符合传染性法氏囊病病毒超强毒株特征。     

Development of Virus-like Particles Containing African Swine Fever Virus Nucleic Acid Sequence and Its Application in Detection Method

African swine fever (ASF) is an infectious disease caused by the African swine fever virus (ASFV). In order to ensure the accuracy and reliability of the test results,it is necessary to develop positive standard control products used in the kit. The study was aimed to develop the virus-like particles containing African swine fever virus (ASFV) nucleic acid sequence and its application in detection method. Fristly,the full-length gene fragment of p72 gene was amplified, and the ASF DNA virus-like particles containing p72 gene was constructed using insect baculovirus system. In order to further validate the reliability of the virus-like particles in the application of the method,DNA nucleic acid was extracted simultaneously with the cultured virus and infected tissue sample and applied in the Real-time quantitative PCR method. The results showed that the virus-like particles prepared by this study could replace the ASFV as a positive control product in the Real-time quantitative PCR method, and could act as quality control during nucleic acid extraction process. In the fluorescent PCR detection kit, the lowest packaging concentration of virus-like particles was 10² TCID₅₀. Further studies had shown that the virus-like particles were also suitable for common PCR and LAMP detection methods, the minimum concentration were 10³ and 10¹ TCID₅₀, respectively. The results of this study would be important for the ASF detection method, promoting the application of the method and ensuring the accuracy and reliability of the test results.     

含非洲猪瘟病毒核酸序列病毒样颗粒的研制及其在检测方法中的应用

非洲猪瘟（African swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）引起的烈性传染病,为了保证其检测结果的准确性和可靠性,需要研制试剂盒中使用的阳性标准质控品。本试验旨在研制含ASFV核酸序列的病毒样颗粒,并探究其在检测方法中的应用。首先扩增p72基因的全长片段,利用昆虫杆状病毒系统,包装出含有p72基因的ASF DNA病毒样颗粒。为了进一步验证该病毒样颗粒在应用中的可靠性,本研究将病毒样颗粒与ASF的组织毒及细胞毒同时进行DNA核酸提取,进行实时荧光定量PCR。结果表明,本研究制备的病毒样粒子能很好的取代ASFV在实时荧光定量PCR检测方法中作为阳性质控品,且能对核酸提取过程进行质控,实时荧光定量PCR检测试剂盒中,病毒样粒子的最低包装浓度为10² TCID₅₀。进一步研究发现该病毒样颗粒也适用于普通PCR及LAMP检测方法中,最低浓度分别为10³和10¹ TCID₅₀。本试验结果将为规范ASF检测方法,促进ASF检测方法的转化应用及保证检测结果的准确度和可靠性提供科学依据。     

基于恒温隔绝式荧光RT-PCR技术现场检测牛纽布病毒方法的建立及应用

纽布病毒(nebovirus,NeV)是引起犊牛腹泻的新发病原，本试验旨在建立基于恒温隔绝式RT-PCR (insulated isothermal RT-PCR,iiRT-PCR)技术现场检测NeV的方法。根据NeV的RdRp基因的保守区域，设计并合成引物和探针，优化检测体系和检测试剂预混方法，建立检测NeV的iiRT-PCR方法。结果显示，成功建立了检测NeV的iiRT-PCR方法，该方法只特异性检出NeV，对牛冠状病毒、牛诺如病毒、A群牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛凸隆病毒、牛大肠杆菌、牛沙门菌、牛瑞氏隐孢子虫和牛艾美尔球虫等无关病原不检出，批间变异系数为3.07%~3.12%，批内变异系数为2.45%~3.01%，检测下限为5.38 copies·μL^-1。应用此方法对2020—2021年采集自红原县、若尔盖县、凉山彝族自治州西昌市和阆中市的101份犊牛腹泻样本进行检测，NeV的检出率为64.36%。本研究成功建立了检测NeV的iiRT-PCR方法，具有特异性强、稳定性好和灵敏度高的特点，检测试剂预混后配合使用PetNAD核酸萃取试剂盒，可实现NeV的现场检测，从核酸提取到报告检测结果仅需1 h，操作方便，为NeV的快速诊断提供了有力的工具。     

用于非洲猪瘟病毒核酸检测的假病毒阳性对照品的制备和标定

【目的】制备安全、稳定的非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)实时荧光定量PCR阳性对照品。【方法】人工合成含ASFVP72、CD2v和MGF360-12L基因片段的核苷酸序列,将3段基因串联插入腺病毒载体PacAd5中,将重组腺病毒质粒和腺病毒骨架质粒共转染293A细胞,利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(EGFP)的表达情况,培养10 d后用PCR方法检测假病毒包装情况,将制备的假病毒颗粒加冻干保护剂制备成阳性对照品,进行均一性和稳定性试验,并对制备好的阳性对照品进行核酸拷贝数的绝对定量。【结果】重组腺病毒质粒和腺病毒骨架质粒共转染293A细胞24 h后出现点状荧光,转染后7 d细胞有形成岛屿状感染区的趋势,转染后10 d细胞出现固缩和脱落等明显细胞病变,收获的假病毒液经PCR检测和测序鉴定,结果显示,能扩增出大小约2 400 bp的阳性条带且测序序列与插入片段一致。均一性试验显示,阳性对照品Ct值的变异系数＜1%,表明均一性良好;加速热稳定性试验显示,制备的阳性对照品分别经4 ℃放置7 d、室温(25 ℃)和37 ℃处理24 h后仍能保持稳定;阳性对照品在DNaseⅠ作用1 h后仍具有良好的稳定性;保存期试验表明制备的阳性对照品在－20 ℃下可稳定保存6个月。经微滴式数字PCR(ddPCR)检测结果显示,制备的阳性对照假病毒液的核酸拷贝数为(2.26±0.09)×10⁴拷贝/μL。【结论】本研究成功制备了含有P72、CD2v和MGF360-12L基因片段的ASFV假病毒阳性对照品,可实现对核酸提取与检测过程的全程监控。     

Effect of a valine residue at codon 352 of the VP2 capsid protein on in vivo replication and pathogenesis of Aleutian disease parvovirus in mink

OBJECTIVE: To determine whether a group of 3 genetic differences in the nonstructural protein (NS1) or 1 genetic difference in the structural protein (VP2) of Aleutian disease parvovirus (ADV) is responsible for an increase in the in vivo replication and pathogenicity of G/U-8, a chimera of ADV-G (nonpathogenic) and ADV-Utah (pathogenic), compared with G/U-10. ANIMALS: 32 eight-month-old female sapphire mink (Mustela vison). PROCEDURE: Chimeric viruses were constructed, propagated in vitro, and used to inoculate mink. Antiviral antibody responses, presence of serum viral nucleic acid, and serum gamma globulin concentrations were monitored for 120 days following inoculation. Histologic examination of the liver, kidneys, spleen, and mesenteric lymph nodes was performed after necropsy. RESULTS: A chimera containing only the 3 amino acid substitutions in NS1 did not elicit measurable responses indicative of replication or pathogenicity in inoculated mink. Serum antiviral antibody responses, frequency of detection of viral nucleic acid in serum, gamma globulin response, and histologic changes in mink inoculated with chimeras containing a valine residue at codon 352 (352V) of VP2 capsid were increased, compared with values from mink inoculated with chimeric viruses that did not contain 352V. CONCLUSIONS AND CLINICAL RELEVANCE: A valine residue at codon 352 in the VP2 capsid protein of ADV affects in vivo viral replication and pathogenicity. This amino acid may be part of an incompletely defined pathogenic determinant of ADV. Further characterization of the pathogenic determinant may allow future development of focused preventive and therapeutic interventions for Aleutian disease of mink.     

我国部分地区猪圆环病毒2型分离株的遗传变异分析

为了解我国猪圆环病毒2型(PCv2)流行毒株遗传变异情况,本研究对本实验室分离到的19株PCV2分离株通过病毒全基因组克隆和测序分析,将其分为2个大基因群和3个亚群,其基因组分别为1 766 nt、1 767 nt和l 768 nt,各占15.8%、73.7%和10.5%.以1 767 nt毒株为基准,其基因组第39或1 039位有1个碱基缺失后突变成1 766 nt毒株;第1 040位有1个碱基插入后突变成1 768 nt毒株.对19株病毒ORF2编码的Cap蛋白分析发现,有4株病毒编码基因发生了突变,出现了705 nt和708 nt两种突变型,使ORF2编码的Cap蛋白C末端分别有1和2个氨基酸增加.同时,本实验选用Acc I和Fba I内切酶对19株病毒基因组PCR产物进行了限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析,其结果可作为流行毒株分型鉴别依据.     

一株源于商品胎牛血清的BVDV-2型的分离鉴定及基因组序列分析

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是引起牛病毒性腹泻/黏膜病的重要病原,也是牛血清及其制品污染中的常见病原体。本研究从商品化胎牛血清中分离到一株致细胞病变（CP）型BVDV（GS2018株）,利用电镜观察、免疫荧光检测、分子鉴定、基因组测序及遗传进化分析对其进行鉴定。结果表明,GS2018株接种MDBK细胞后可见明显的细胞病变（CPE）,培养第4天病毒滴度达1×10^6.2·0.1 mL^-1。病毒粒子呈圆形,直径为50~60 nm,间接免疫荧光检测为阳性;其5'UTR扩增片段与BVDV-2相应序列高度相似,病毒基因组包含12 235个核苷酸（nt）。5'UTR、N^pro及E2基因系统进化分析发现,GS2018株与美国BVDV-2 USMARC-60764分离株核苷酸一致性达98%,证明其属于CP型BVDV-2a亚型。但GS2018株在NS2/3区无核酸片段插入,这与大多数CP型BVDV-2明显不同,说明BVDV致细胞病变可能涉及更复杂的机制。