猪肌肉生长抑制素基因的克隆及原核表达

本试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。根据基因库肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点及保护碱基,提取汉普夏猪的骨骼肌总RNA,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后EcoRⅠ和SalⅠ双酶切,克隆到pET-30a( )中,构建原核表达载体pET-30a-M,将重组表达质粒转化至E.coliBL21(DE3)中,诱导表达。结果表明,成功扩增出肌肉生长抑制素全长基因;克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与国外报道的完全一致;成功构建原核表达载体pET-30a-M;经IPTG诱导,表达出了6×His-M融合蛋白,用组氨酸标签抗体做Western印记证明产物大约48 ku,与预期大小相符,肌肉生长抑制素蛋白在大肠杆菌中成功的进行了表达。     

水牛抑制素α亚基基因的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法从水牛卵巢总RNA中扩增抑制素α亚基基因,并克隆入pMD18-T载体,进行PCR、双酶切及测序鉴定.序列分析结果表明:水牛抑制素α亚基基因编码序列长为1 083 bp,编码360个氨基酸,与牛、人、猪抑制素α亚基基因CDS成熟蛋白氨基酸的同源性分别为96%、80%、87%,表明抑制素α亚基是一组在进化上高度保守的蛋白质.将水牛抑制素α亚基基因CDS克隆到pET-30a表达载体中,转化宿主菌BL21(DE3)进行原核表达.在1 mmol/L IPTG 中,37 ℃诱导表达4 h后抑制素α亚基基因重组蛋白可成功获得表达.将表达产物进行SDS-PAGE分析,结果表达产物主要以包涵体形式存在,分子质量约为40 ku.     

牛肌肉生成抑制素基因功能区的克隆与原核表达

根据GenBank中牛肌肉生成抑制素（MSTN）基因序列设计了1对引物，在引物两端分别加EcoRⅠ和XhoⅠ识别位点。利用RT—PCR技术扩增出了牛MSTN功能区序列。分别构建克隆和原核表达载体，酶切、PCR鉴定及测序分析表明，该基因功能区序列的克隆载体和原核表达载体已成功构建。筛选阳性菌，经IPTG诱导，牛MSTN基因功能区在大肠埃希氏菌中成功表达。     

秦川牛生长抑制素基因克隆及原核表达研究

 试验旨在通过基因工程方法获得重组肌肉生长抑制素蛋白。提取秦川牛的骨骼肌总RNA,根据基因库中海福特牛肌肉生长抑制素基因序列设计合成特异性引物,引物两端分别加上Bam HⅠ和Xho Ⅰ酶切位点及保护碱基,用RT-PCR方法扩增肌肉生长抑制素全长基因,并将其克隆到pMD18-T载体上,测序后经Bam HⅠ和Xho Ⅰ双酶切,将目的片段插入到PGEX-4T-1中,构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,将重组表达质粒转化至Rosetta(DE3)中诱导表达。结果表明,扩增的秦川牛肌肉生长抑制素全长基因1 128 bp,克隆载体经过DNA序列测定,所得基因与GenBank上发表的一致;成功构建原核表达载体PGEX-4T-1-M,经IPTG诱导,表达出了GST-M融合蛋白,用GST标签抗体做Western blotting印记证明产物大约69 ku,与预期大小相符,并在Rosetta（DE3）菌中成功的进行融合蛋白表达。     

猪卵泡抑制素α模拟肽基因在大肠杆菌中的融合表达

克隆了猪抑制素 α1 - 3 2 基因 (简称抑制素基因 ,INH) ,与 p ET- 32 c载体的 Thioredoxin基因重组 ,表达的 INH-Thioredoxin融合蛋白相对分子质量约 140 0 0 ,在 E.coli DH5α中表达效率较高。在 IPTG浓度为 0 .34 0 m mol/L、诱导16 .8h条件下 ,有最大表达量 ,电泳扫描净灰度达 38.78%。     

猪肌生成抑制素C末端80氨基酸编码基因的合成及其原核表达

将猪肌生成抑制素编码序列下游883～1 126 bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化,将优化后序列双链分成12个单链片段(F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F6、R3、R2、R1),采用化学合成方法合成,每对相邻互补片段之间有20 bp序列交叉重叠.F1长38 bp,R1长36 bp,其他片段均40bp长,F1和R1片段两端分别加上限制性内切酶Nco I和Xho I的识别位点序列.经PCR扩增出254 bp片段,该片段与pMD18-T载体连接,转化JM109感受态细胞,所得阳性克隆进行测序分析,得到的克隆序列与设计的序列完全一致,表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体.从阳性细菌中提取质粒,经Nc0 I和Xho I酶切,回收254 bp目的片段,定向克隆到pET28a中,转化DH5.受体菌,提取质粒,再转化到BL21(DE3)中,成功筛选出阳性克隆.阳性菌经IPTG诱导,通过SDS PAGE,检测出猪肌生成抑制素的表达.     

也木勒羊抑制素α亚基基因克隆及其真核表达

为了克隆也木勒白羊抑制素α(inhibin α,INHα)亚基基因和表达其重组蛋白质,本试验采集发情期也木勒白羊卵巢组织,并从中快速抽提总RNA,以此作为模板并根据白羊INHα亚基基因编码区序列(GenBank登录号:XM_004004955.1)设计合成1对引物,经反转录扩增获得了也木勒白羊INHα亚基基因编码区全长序列.并将扩增产物克隆到表达载体(pEGFP-N1)的Scal Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点之间,构建重组质粒pEGFP-INHα并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,后进行鉴定、测序,证明成功构建了INHα亚基基因的真核表达载体.将也木勒白羊INHα亚基基因与人、大猩猩、牛等动物的INHα亚基基因序列进行同源性比对分析,相似度都在50%以上,说明了抑制素基因具有高度保守性.用RT-PCR和Western blotting方法验证了INHα亚基基因的真核表达载体在BHK细胞中的成功表达及蛋白表达.     

猪肌生成抑制素C末端80氨基酸编码基因的合成及其原核表达

将猪肌生成抑制素编码序列下游883-l126bp按大肠杆菌嗜好密码子进行优化，将优化后序列双链分成l2个单链片段(F1、F2、F3、R6、R5、R4、F4、F5、F7、R3、R2、R1)，采用化学合成方法合成，每对相邻互补片段之间有20bp序列交叉重叠。F1长38bp，Rl长36bp，其他片段均40bp长，Fl和R1片段两端分别加上限制性内切酶NcoI和XhoI的识别位点序列。经PCR扩增出254bp片段，该片段与pMDl8—T载体连接，转化JMl09感受态细胞，所得阳性克隆进行测序分析，得到的克隆序列与设计的序列完全一致，表明成功地获得了猪肌生成抑制素下游编码序列克隆载体。从阳性细菌中提取质粒，经NcoI和XhoI酶切，回收254bp目的片段，定向克隆到pET28a中，转化DH5α受体菌，提取质粒，再转化到BL2l(DE3)中，成功筛选出阳性克隆。阳性菌经IPTG诱导，通过SDS—PAGE，检测出猪肌生成抑制素的表达。     

新疆细毛羊抑制素α亚基cDNA的克隆、序列分析与表达

根据GenBank上登录的绵羊抑制素α亚基基因序列,设计合成2对引物,以新疆细毛羊卵巢提取的总RNA为模板,采用RT—PCR方法扩增获得了约812bp片段,经pMD18-T载体克隆和测序分析证实为新疆细毛羊抑制素α亚基前体基因。进一步通过PCR反应扩增新疆细毛羊INHα亚基基因片段,经过NcoⅠ和HindⅢ双酶切后定向克隆于pET32a原核表达载体,获得pET—INH重组表达载体。将携带有重组表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）通过1 mmol·L^-1IPTG进行诱导表达,经过SDS-PAGE电泳检测,显示诱导表达蛋白大约为32ku,与预期表达蛋白大小一致。Western blot检测表明重组原核表达载体在大肠杆菌中成功表达出了目的融合蛋白。新疆细毛羊抑制素α亚基基因的克隆、表达为进一步研究其功能和应用奠定了基础。     

溆浦鹅卵泡抑制素α亚基编码区cDNA克隆及其原核表达

根据GenBank中鸡卵泡抑制素α亚基序列设计引物，对该序列按大肠杆菌嗜好密码子进行优化，在设计的引物两端分别加上限制性内切酶SacⅠ和XhoⅡ的识别位点序列。利用RT-PCR技术从溆浦鹅卵泡的颗粒细胞总RNA中扩增出抑制素α亚基成熟区序列，经PCR扩增出354bp片段，该片段与pMD18-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行双酶切鉴定和PCR鉴定，并进行了测序分析，得到的克隆序列与设计的序列基本一致。表明成功地获得了抑制素α亚基编码序列的克隆载体。从阳性细菌中提取质粒，经SacⅠ和XhoⅠ酶切，回收354bp目的片段，定向克隆到pET28a中，转化DH5α受体菌，提取质粒，再转化到BL21(DE3)中，成功筛选出阳性克隆。阳性菌经IPTG诱导，通过SDS-PAGE，检测出溆浦鹅卵泡抑制素α亚基编码区的表达。