家蚕Mod基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

已知多数含BTB/POZ结构域的锌指蛋白对生物体的发育、分化及染色体重组等具有重要的调节作用。从已构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条编码MOD(mdg4)蛋白的基因序列(GenBank登录号:DN237077)。该基因序列的ORF长1 080 bp,编码359个氨基酸残基,蛋白含有BTB保守结构域和FLYWCH保守结构域,与黑腹果蝇、冈比亚按蚊、赤拟谷盗和埃及伊蚊的MOD多序列比对,其同源性不超过40%。表达、纯化带有His标签的家蚕MOD蛋白(BmMOD),并用纯化的融合蛋白免疫新西兰兔获得多克隆抗体。实时荧光定量PCR显示BmMod基因mRNA转录水平在家蚕蛾期及5龄幼虫的卵巢最高,推测BmMod基因在家蚕生殖腺发育过程中产生一定作用。利用纯化的BmMOD蛋白多克隆抗体进行Western blotting分析也表明该蛋白在家蚕蛾期及5龄幼虫卵巢中的表达量最高,验证了BmMod在家蚕生殖腺发育中的功能。亚细胞定位结果显示BmMOD蛋白几乎完全定位于家蚕卵巢上皮细胞(BmN)的细胞核中。     

家蚕丝腺因子SGF-1的基因克隆及序列结构和表达特征与亚细胞定位

Fox类转录因子在细胞生长、增殖、分化和胚胎发育等过程中发挥重要功能,SGF-1是家蚕丝腺细胞转录因子,属于Fox类转录因子家族。家蚕SGF-1(BGIBMGA005101-TA)基因位于第25号染色体nscaf2823:112743~113792(+strand),含有1个外显子,CDS全长1 050 bp,编码349个氨基酸。家蚕品种大造5龄第3天幼虫的基因芯片表达谱显示,SGF-1基因在大多数组织中有表达,在丝腺中高量表达,其中在前部和中部丝腺的表达量略高于后部丝腺,在雄蚕中的表达量略高于雌蚕。氨基酸组成分析显示,SGF-1蛋白富含脯氨酸、丝氨酸、丙氨酸和亮氨酸,且多数为亲水性氨基酸。序列结构分析表明,SGF-1包含典型的Forkhead结构域,其两端分别为Forkhead_N末端结构域和HNF3_C末端结构域,其中大多数氨基酸残基形成了无规则卷曲结构,α-螺旋与β-折叠结构分别约占18.0%和0.6%。从家蚕后部丝腺克隆了SGF-1基因,并构建麦芽糖结合蛋白标签融合表达载体,表达并纯化了重组SGF-1蛋白。通过RT-PCR与Western blotting检测分别从基因转录水平和蛋白质表达水平上证实,SGF-1在家蚕5龄第3天幼虫丝腺中高量表达。亚细胞定位实验显示SGF-1定位于细胞核中。这些结果为深入研究SGF-1的结构和功能提供了有益的基础信息。     

家蚕精巢特异性蛋白激酶基因Bm-TSSK的克隆及序列与表达分析

睾丸特异性丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(testis-specific serine/threonine kinase,TSSK)首先在哺乳动物中被发现,是一类在精子发生过程起重要作用的蛋白激酶。通过EST同源筛选方法,用人(Homo sapiens)的TSSK2、TSSK4、TSSK6基因cDNA和小鼠(Mus musculus)的TSSK1、TSSK3、TSSK5基因cDNA为探针在GenBank家蚕EST数据库中搜索同源基因,通过在家蚕基因组数据库的同源性检索以及电子克隆,获得一条家蚕精巢特异性蛋白激酶基因的序列,命名为Bm-TSSK(GenBank登录号:JN159476)。据此预测序列设计引物,成功地在家蚕精巢组织中克隆了Bm-TSSK基因完整的开放阅读框(ORF),序列分析及同源性比对表明:Bm-TSSK序列长1 402 bp,ORF为1 041 bp,没有内含子,推测编码346个氨基酸残基,在编码氨基酸序列20～284区域有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的结构域;该基因推导的氨基酸序列在进化上与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、熊蜂(Bombus terrestris)、顶切叶蚁(Acromyrmex echinatior)的亲缘关系较近,相似度分别为81%、86%和85%。基于定量PCR和基因芯片的数据分析显示Bm-TSSK在家蚕5龄第3天幼虫的精巢特异性高表达,推测Bm-TSSK参与了家蚕精子的形成。     

家蚕周期蛋白A基因(BmcyclinA)的克隆和表达谱分析

周期蛋白A(cyclinA)能分别与2种重要的周期蛋白依赖性激酶cdk1和cdk2作用,推动细胞周期的正常进行。利用家蚕基因组数据和分子生物学方法克隆了cyclinA基因在家蚕中的同源物BmcyclinA(GenBank登录号:FJ619105),发现了BmcyclinA基因的另一种错误剪接形式BmcyclinA-1。BmcyclinA基因位于家蚕第13号染色体,由7个外显子和6个内含子组成,其完整开放阅读框为1 533 bp,编码511个氨基酸,在248th-450th氨基酸区域存在2个保守的周期蛋白框。BmcyclinA-1仅能编码正常cyclinA蛋白N端的153个氨基酸残基。RT-PCR分析显示BmcyclinA基因在家蚕整个胚胎发育时期及5龄第3天各组织中均有表达,并且在幼虫精巢中的表达相对较高。     

家蚕SoxE基因的全长cDNA克隆和表达谱分析

Sox基因家族是在动物中发现的一类重要的转录调控因子。基于生物信息学和RACE策略,从家蚕胚胎中克隆了一个与果蝇E族Sox基因成员同源的基因的全长cDNA,命名为BmSoxE(GenBank登录号:HQ728280)。BmSoxE的cDNA序列全长为1 398 bp,编码222个氨基酸。生物信息学分析显示,BmSoxE蛋白序列含有典型的HMG-box结构域和数个磷酸化位点。组织表达谱分析发现,BmSoxE基因在家蚕生殖腺中高量表达;时期表达谱分析表明,从家蚕的幼虫期一直到成虫期,Bm-SoxE基因的表达维持在较高水平,暗示BmSoxE基因在家蚕性别决定和分化中可能发挥了调控作用。     

家蚕脂围蛋白(PLIN)基因的序列分析及表达与亚细胞定位研究

脂围蛋白(perilipin)与脂肪细胞脂类代谢的调节有关。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到一条cDNA开放阅读框(ORF)序列长度为918 bp的基因,预测其编码305个氨基酸残基,蛋白分子质量约32.5 kD。经NCBI比对发现该蛋白具有部分脂围蛋白的保守结构域,因此将该ORF序列命名为BmPLIN基因。将该基因插入到载体pET-28a(+)的多克隆位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmPLIN,并转化大肠杆菌中进行原核表达得到带有His标签的融合蛋白,表达的融合蛋白以包涵体形式存在。用纯化后的融合蛋白为抗原免疫大白兔获得多克隆抗体,ELISA间接法测定抗体的效价达到1∶12 800以上。通过荧光定量PCR和Western blotting技术对BmPLIN基因及其编码蛋白在家蚕5龄幼虫各个组织器官中的转录、表达水平进行分析的结果是:BmPLIN基因mRNA在家蚕5龄幼虫各组织器官中的转录水平由高到低依次为生殖腺(卵巢和睾丸)、脂肪体、肠、表皮、头部、马氏管、丝腺、气门,在家蚕5龄幼虫的生殖腺(卵巢和睾丸)中有明显的BmPLIN蛋白特异条带。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞实验的结果显示,BmPLIN蛋白在细胞质和细胞核中均有分布。     

家蚕脂质运载蛋白基因BmLip32的特征与表达活性分析

从已构建的家蚕蛹期cDNA文库中筛选得到一条新的cDNA片断,经生物信息学分析发现其编码框具有脂质运载蛋白(lipocalin)保守结构域,命名为BmLip32基因,GenBank登录号为FJ602775。构建融合表达质粒pET-28a-BmLip32后转化大肠杆菌BL21并诱导表达,将纯化的His-BmLip32融合蛋白免疫新西兰大白兔成功制备多克隆抗体,效价大于1∶12 800。RT-PCR检测结果表明BmLip32在家蚕蛹期转录水平最高,在5龄幼虫头部中的转录水平明显高于其它组织。Western blotting分析结果显示BmLip32在5龄幼虫头部大量表达。免疫细胞化学实验显示BmLip32蛋白存在于家蚕Bm5细胞的细胞质中。推测BmLip32基因是家蚕神经系统发育相关的重要调控基因。     

家蚕BmLHep_59蛋白的表达和亚细胞定位

肝细胞癌相关抗原-59(hepatocellular carcinoma-associated antigen59,Hep_59)属于哺乳动物中一类含有约100个氨基酸残基的保守结构域家族,这类蛋白主要存在于真核生物细胞中,大多为假想蛋白。从家蚕蛹cDNA文库中筛选的一个新基因,其编码蛋白含有一个和Hep_59高度同源的保守结构域,将其命名为BmLHep_59(GenBank登录号:DN985181)。PCR扩增该基因的ORF,经EcoRⅠ/XhoⅠ双酶切重组到原核表达载体pET-28a(+),并转入E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞中表达。通过镍柱亲和层析得到纯化的重组蛋白BmLHep_59,并以此纯化重组蛋白作为抗原免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经ELISA检测抗血清效价可达1∶12 000以上。用Western blotting检测到家蚕5龄幼虫的表皮、丝腺和血淋巴中均有BmLHep_59表达,其中在血淋巴的表达量较高,暗示该蛋白可能参与调控家蚕的造血机能。该蛋白在蛹期中也有表达。亚细胞定位显示BmLHep_59在家蚕Bm5细胞的细胞质和细胞核中均有分布。     

家蚕RYBP基因的结构与表达模式分析及转基因干涉系统的建立

多梳蛋白(polycomb group,PcG)是一类对生物有机体生长发育很重要的转录抑制因子,参与有机体的发育调控。Ring和YY1结合蛋白(Ring and YY1 binding protein,RYBP)是在小鼠(Mus musculus)和果蝇(Drosophila melanogaster)中推断的PcG蛋白成员。基于生物信息学分析方法,设计引物克隆了家蚕的RYBP基因(BmRYBP);序列结构分析显示该基因有一个420 bp的完整ORF,由3个外显子和2个内含子组成,编码139个氨基酸,预测其蛋白质分子质量为15.4 kD,等电点为10.36,N端的20～44 aa有一个与蛋白间相互作用有关的锌指结构域(ZnF-RBZ);半定量RT-PCR分析显示,该基因在家蚕5龄3 d幼虫生殖腺中高水平转录;基于GAL4/UAS双元系统,构建了具有BmRYBP序列反向重复结构的转基因干涉表达载体,通过显微注射家蚕早期胚胎,获得了UAS系统的转基因家蚕后代,为研究BmRYBP在家蚕生长发育过程中行使的功能奠定了基础。     

家蚕糖转运蛋白基因BmST3的克隆及序列分析与表达研究

糖转运蛋白在家蚕体内糖类化合物的转运与代谢过程中发挥重要作用。在电子克隆的基础上,通过RT-PCR方法克隆了家蚕糖转运蛋白基因BmST3(GenBank登录号:GQ871756)。生物信息学分析结果显示,该基因位于家蚕27号染色体,开放阅读框(ORF)长1434bp,编码477个氨基酸,预测蛋白有典型的Sugar_tr结构域和12个疏水的跨膜结构域,与埃及伊蚊、致倦库蚊、冈比亚按蚊、赤拟谷盗登录号分别为EAT47626、EDS35465、EAA11457、EFA05337的同源蛋白相似性均在60%以上。RT-PCR检测和基因芯片信号值分析结果显示,BmST3基因的表达具有组织特异性,在家蚕5龄第3天幼虫的9种组织中,主要在马氏管中大量表达,推测其可能在马氏管细胞膜内外物质的跨膜转运中发挥作用。     

家蚕Ssu72蛋白基因的克隆及序列与表达分析

Ssu72(suppressor of sua7-1 clone 2)蛋白的命名源于对酵母sua7-1基因突变的抑制作用,推测其在真核生物RNA聚合酶Ⅱ作用的转录过程中有重要功能。从家蚕蛹cDNA文库中筛选到家蚕Ssu72蛋白基因(BmSsu72)的cDNA序列,利用生物信息学方法分析该基因ORF为579 bp,编码蛋白质含有192个氨基酸残基,具有完整的Ssu72保守结构域,三级结构包含9个α螺旋和4个β折叠,推测α螺旋和β折叠之间可能形成锌指结构。以家蚕蛹cDNA为模板PCR克隆到BmSsu72基因的完整ORF序列,通过构建载体pET-28a(+)-BmSsu72在大肠杆菌中表达并纯化了重组BmSsu72蛋白,进而利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。采用荧光定量PCR检测到BmSsu72基因随着家蚕的生长发育转录水平呈逐渐下降趋势,在卵期的转录水平最高,在蛾期的转录水平最低;该基因在5龄幼虫各组织中的转录水平以马氏管最高,卵巢和丝腺次之。Western blotting检测BmSsu72在家蚕5龄幼虫各个组织中均有表达,其中在丝腺中的表达水平最高。推测BmSsu72可能与家蚕丝腺的分泌相关。     

野桑蚕和不同家蚕品系幼虫体内1-脱氧野尻霉素含量测定

采用反相高效液相色谱(RP-HPLC)-紫外检测法测定了野桑蚕和不同品系家蚕体内的1-脱氧野尻霉素(1-DNJ)含量,并调查了家蚕5龄幼虫不同组织不同生长时期1-DNJ含量的变化。野桑蚕与家蚕、家蚕不同品系间的1-DNJ含量存在极显著差异:野桑蚕全蚕粉中1-DNJ含量最高,质量分数平均为0.427 8%;家蚕以黄血蚕最低,平均0.220 5%。家蚕5龄幼虫不同组织的1-DNJ含量也存在明显差异:家蚕血干粉中的1-DNJ含量最高,质量分数达0.848 7%;其次是中肠、体壁和脂肪体组织,分别为0.512 2%、0.472 2%、0.308 5%;而在丝腺中几乎检测不出1-DNJ。家蚕5龄幼虫体内1-DNJ含量随发育时期呈明显变化,5龄第4天含量最高,达0.329%,第5天以后迅速下降。     

氟化物对不同抗性家蚕品种的GST和AChE酶活性影响及雌雄个体间的酶活性差异

为了探明家蚕的耐氟性机制以及耐氟性在不同性别蚕体间的差异,以家蚕耐氟品种T6和氟化物敏感品种734为材料,自5龄起蚕开始分雌雄喂食清水和200 mg/kg NaF溶液浸泡后的桑叶,检测幼虫中肠谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和头部乙酰胆碱酯酶(AChE)的活性变化。添食氟化物后耐氟和敏感家蚕品种5龄幼虫中肠的GST活力随添氟时间的变化趋势与对照组比较一致,且与对照组相比酶活性均呈增高趋势;敏感品种734添氟组5龄雌蚕的GST平均活力为雄蚕的1.486倍,耐氟品种T6添氟组5龄雌蚕的GST平均活力为雄蚕的1.529倍。敏感品种734对照组5龄幼虫在试验第3天头部的AChE酶活性显著升高,但添氟组雄蚕在试验第2天AChE酶活性即显著升高,而雌蚕的AChE酶活性在整个5龄试验期均呈平缓下降趋势;耐氟品种T6添氟组5龄雌、雄幼虫的AChE活力与对照组差异不大,酶活力随添氟时间的变化趋势也与对照组较为一致,均在第3天出现最低值;2个品种添氟组AChE酶活性的性别差异与GST相反,即雄蚕的AChE平均活力大于雌蚕。推测氟化物处理后耐氟家蚕品种仍然能够保持AChE酶活性水平,从而呈现对氟化物的耐受性;2种类型解毒酶活力在雌雄家蚕间的差异可能暗示同一品种雄蚕的耐氟能力较多涉及靶标抗性,而雌蚕的耐氟能力较多依赖于代谢抗性。     

抗菌药物亚迪蚕安宁在蚕体内的药物代谢动力学特征分析

蚕用抗菌药剂亚迪蚕安宁是喹诺酮类抗生素药物,研究该药物在蚕体内的药物代谢动力学特征,作为制定蚕病防治合理给药方案的理论依据。分别给家蚕5龄第4天健康幼虫添食2.5、5、10 mg/kg 3种剂量(药物与试验组蚕体总质量比)的亚迪蚕安宁后,于不同时间采集幼虫血样用抗生素微生物法检测血药浓度,药时数据经3P97药动学程序计算AIC值分别为-0.208、11.387和38.806,显示拟合度良好。主要药动学参数:吸收速率常数(ka)分别为0.148、0.190、0.281 h-1,达峰时间(Tmax)分别为3.764、3.993、3.613 h,最高血药浓度(Cmax)分别为2.334、3.576、9.786μg/mL,清除率(Cl)分别为0.089、0.134、0.133 L/h。以实测血药浓度-时间曲线与理论血药浓度-时间曲线的相关系数(R2)和AIC值作为识别模型的指标,拟合家蚕食下亚迪蚕安宁蚕体内的血药浓度-时间曲线,符合一级吸收一室开放式模型。试验结果表明:亚迪蚕安宁在蚕体内具有吸收迅速,达峰时间短,最高血药浓度与添食剂量成正比,消除半衰期较短等药物代谢动力学特征,适合日内多次给药。     

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16的表达规律及体外重组表达

家蚕(Bombyxmori)的丝腺是丝蛋白合成分泌的场所,存在多种丝氨酸蛋白酶抑制剂。为探究家蚕丝蛋白的合成和保护机制,采用半定量RT-PCR的方法调查家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin16在家蚕不同发育时期和5龄第5天幼虫各个组织器官中的表达特征,结果表明家蚕serpin16基因仅在4眠-5龄第6天的发育期表达,并且仅在丝腺中特异表达,其中在中部丝腺前区转录水平最高,而在中部丝腺中区和后区的转录水平较低;进一步构建pGEX-4T-1-serpin16原核表达载体,并转化至大肠杆菌(Eschevichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导获得融合蛋白,纯化后得到单一的目的蛋白。家蚕serpin16基因在幼虫丝腺的特异表达模式提示其可能与家蚕的吐丝过程密切相关,推测该基因在维持丝腺稳定的泌丝环境中发挥重要作用。     

农药氰戊菊酯和杀虫双诱导家蚕血液蛋白的变化

为了解析家蚕对常用农药氰戊菊酯和杀虫双的解毒机制,分别给家蚕5龄幼虫添食2种农药,观察家蚕对农药的中毒症状,采用双向电泳(2-DE)技术对添食农药的家蚕幼虫的血液蛋白进行分离,利用电喷雾电离(ESI)质谱对具有2次以上重复的显著差异蛋白点进行鉴定,并用生物信息学方法进行分析。家蚕5龄幼虫分别添食1/4LD50剂量浓度的2种农药后,均在3～12h内出现中毒症状,且血液蛋白的表达也发生了变化:在氰戊菊酯诱导下,幼虫血液中增加了纤维样蛋白、果糖-1,6-二磷酸醛缩酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂;在杀虫双诱导下,幼虫血液中增加了丝氨酸蛋白酶抑制剂-13;经2种农药分别诱导处理后3h,幼虫血液中都减少了体液低分子蛋白-Ⅲ的表达。推测家蚕对氰戊菊酯和杀虫双具有一定的免疫反应。     

农药灭多威不同剂型产品对家蚕的毒性评价

为了评估农药灭多威不同剂型产品应用于桑园害虫防治对家蚕安全性的影响,选用目前生产上常用的20%灭多威乳油、24%灭多威可溶性液剂和40%灭多威乳油3种不同剂型产品,稀释成不同质量浓度药液浸泡桑叶后给家蚕3龄幼虫添食,测定其对家蚕的急性毒性。结果表明:3种剂型产品对家蚕3龄幼虫的24 h食下LC50在14.626 4～17.617 9 mg/L之间,48 h食下LC50在10.760 3～11.498 7 mg/L之间,72 h食下LC50在9.450 2～10.213 7 mg/L之间,差异均不显著(P>0.05);3种剂型产品对家蚕3龄幼虫的24 h毒力和72 h毒力之间差异显著(P<0.05);3种剂型产品对家蚕3龄幼虫的毒力回归方程的坡度均在48 h最大,说明灭多威对3龄幼虫的毒力发挥最大时间在食下后48 h。将灭多威农药的3种剂型产品稀释成含灭多威质量浓度为66.67、133.33、266.67 mg/L的3种药液,分别喷施桑树后检测对家蚕的残毒期长短略有差异,以24%灭多威可溶性液剂3 600倍稀释液处理组的残毒期最短(8 d),结合毒力测定,确定灭多威3种剂型产品对家蚕的安全性间隔期为8～12 d。     

云南蚕区部分家蚕品种资源对BmNPV抵抗性的初步调查

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是云南蚕区对家蚕危害最严重的病毒病病原。为了筛选对BmNPV具有较强抵抗能力的家蚕品种资源作为抗病育种素材,以云南省保存的18个家蚕品种(品系)为材料,于3龄起蚕经口接种BmNPV,调查不同品种(品系)对BmNPV的抵抗性。不同家蚕品种对BmNPV的抵抗能力存在显著差异,供试品种中云8B的抵抗能力最强,发病率仅为28.9%,而红云B的发病率却高达100%,品种间发病率最大相差71.1个百分点;发病率55%以下的品种多数为日系品种,但品种间发病率最高(红云B)和最低(云8B)的均为日系品种。一些对BmNPV抵抗能力较强的品种全茧量较高,但品种对BmNPV的抵抗能力与全茧量没有严格的相关关系。     

三眠蚕诱导剂SM-1对家蚕丝蛋白合成调控机理的研究——Ⅱ.SM-1对后部丝腺DNA合成速率和核酸含量的影响

本文探讨三眼蚕诱导剂SM一1对家蚕丝蛋白合成的调控机理.试验结果表明:(1)sM-1处理后,家蚕后部丝腺DNA中~3H-胸腺嘧啶核苷的参入速率明显增快.SM一1诱导三眠蚕在四龄第2天~3H-胸腺嘧啶核苷的参入量最高,比同时的对照高近1倍;五龄第2天SM—1处理区,在五龄第3天~H-胸腺嘧啶核苷的参入速率有所增快.(2)SM-1诱导的三眠蚕,后丝腺DNA和RNA含量的高峰比对照提前4-6天出现,且其末龄(四龄)DNA和RNA含量的增减趋势与对照末龄(五龄)DNV和RNA含量的增减趋势非常相似.(3)五龄前期用SM一1处理家蚕幼虫,对后丝腺DNA和RNA含量增加具有暂时的促进作用.