β-catenin在lα,25-(OH)_2D_3调控小鼠体外破骨细胞形成中的作用

旨在探究β-catenin在lα,25-(OH)_2D_3调控小鼠体外破骨细胞(osteoclast,OC)形成中的作用。体外诱导小鼠OC形成,添加1α,25-(OH)_2D_3观察其对OC形成及β-连环蛋白(β-catenin)表达的影响;敲低β-catenin进一步观察1α,25-(OH)_2D_3对OC形成的影响。结果显示,1α,25-(OH)_2D_3极显著(P0.01)抑制体外培养小鼠OC形成和骨吸收活性。敲低β-catenin,OC数量及OC形成标志物基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白和激活T-细胞核因子1(nuclear factor of activated T cells,cytoplasmic 1,Nfatc1)mRNA表达显著(P0.05)升高。1α,25-(OH)_2D_3可促进OC形成过程中β-catenin基因Ctnnb1 mRNA的表达,但敲低β-catenin基因,1α,25-(OH)_2D_3仍可抑制OC形成。试验表明,β-catenin可抑制体外培养OC形成,但对1α,25-(OH)_2D_3抑制OC形成无影响。     

维生素D介导鸡BMSCs和BMMs共培养体系中破骨细胞的形成

为探究1α, 25-(OH)_2D_3对鸡骨髓间充质干细胞(BMSCs)和骨髓单核巨噬细胞(BMMs)体外共培养体系中破骨细胞(OC)形成的影响,笔者对1α, 25-(OH)_2D_3处理后的细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP)、骨吸收功能鉴定、OC标志基因mRNA和蛋白表达的检测。结果表明:1α, 25-(OH)_2D_3能够上调BMSCs中核因子κB受体活化因子配体(RANKL)的表达,下调骨保护素(OPG)的表达。1α, 25-(OH)_2D_3处理共培养细胞5 d,OC数目较对照组明显增多,骨吸收活性较对照组极显著增强,基质金属蛋白酶9(MMP-9)、Ⅱ型碳酸酐酶(CAⅡ)、组织蛋白酶K(CtsK)及TRAP等标志性蛋白的mRNA和蛋白表达极显著高于对照组(P0.01),其中10~(-8) mol·L~(-1) 1α, 25-(OH)_2D_3效果最明显。结果表明,10~(-8) mol·L~(-1) 1α, 25-(OH)_2D_3能够介导鸡BMSCs和BMMs共培养体系中OC的形成,该OC具有骨吸收活性,为进一步研究OC在家禽骨骼及钙磷代谢紊乱性疾病中的作用机制奠定基础。     

一周岁内滩羊皮肤差异表达蛋白研究

为研究一周岁内滩羊皮肤中的差异表达蛋白,本试验利用双向凝胶电泳（2-DE）技术分离了滩羊不同生长阶段皮肤蛋白,经考马斯亮蓝染色,用PDQuest 8.0软件检测并分析差异蛋白点,并经MALDITOF/TOF-MS/MS鉴定。对4个生长时期的蛋白图谱进行两两比对,共发现了19个差异蛋白点,质谱成功鉴定出15个蛋白点共13种蛋白,可能与滩羊皮肤生长调控有关的蛋白有14-3-3蛋白σ亚型（14-3-3 protein sigma）、膜联蛋白A2（annexin A2）、角蛋白25（keratin 25）、微管蛋白α链（tubulin alpha chain）。对差异表达蛋白进行分析,发现这些差异表达蛋白可能与滩羊皮肤不同生长阶段的毛囊周期性变化有关。一周岁内滩羊皮肤差异蛋白的发现为滩羊皮肤的年变化规律研究奠定理论基础。     

H5N1亚型禽流感病毒感染小鼠肺组织蛋白质组分析

为鉴定禽流感病毒(AIV)感染状态下的差异表达蛋白,本研究将H5N1亚型AIV感染组与对照组小鼠肺组织蛋白样品分别进行双向电泳分离,并采用ImageMaster 2D Platinum 6.0软件进行分析.在AIV感染72 h后,共有9个表达差异显著的蛋白点(ratio＞2,p＜0.05),而且该蛋白在感染组均呈上调表达.将差异蛋白进行串联质谱分析,并对其中7个蛋白进行鉴定,包括:interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 3(IFIT-3)、ATP依赖的干扰素反应蛋白1(ADIR1)、γ干扰素诱导的p47鸟苷三磷酸酶(IRG)、T细胞受体a TA27、气味受体S86、胞苷单磷酸激酶2(Cmpk2)和肌球蛋白.将前3个蛋白基因采用荧光定量PCR方法进行mRNA水平的验证,所获得的结果与双向电泳结果一致.本研究为在蛋白质组水平进一步分析H5N1亚型AIV与宿主相互作用奠定了基础.     

5α-双氢睾酮对大脑皮质组织结构和细胞凋亡的影响

采用免疫组织化学、Western blot等方法,研究了5α-双氢睾酮对大脑皮质组织结构和细胞凋亡的影响。结果显示:(1)去睾丸引起大脑皮质神经元数量下降,细胞凋亡数量增加,部分神经元线粒体、内质网肿胀,出现凋亡小体,髓鞘板层疏松、分离并脱髓鞘,雄激素受体、Bcl-2表达下降,GFAP、BAX表达增加,与正常组、假手术组和去睾丸后补充5α-双氢睾酮组比较,均呈显著性差异(P<0.05);(2)与去睾丸组比较,去睾丸后补充5α-双氢睾酮引起神经元数量增加,细胞凋亡数量减少,神经元线粒体、内质网等细胞器结构正常,雄激素受体、Bcl-2表达增加,胶质纤维酸性蛋白、BAX表达下降,且均呈显著性差异(P<0.05);(3)正常组、假手术组和去睾丸后补充5α-双氢睾酮组之间,以上各试验观察指标均无显著性差异(P>0.05)。结果表明,5α-双氢睾酮可通过与雄激素受体结合,促进Bcl-2表达,抑制胶质纤维酸性蛋白、BAX表达,维持神经元、胶质细胞正常的超微结构,阻止细胞凋亡,保持神经元数量正常,实现对大脑皮质的保护。     

基于iTRAQ技术伪狂犬病毒感染宿主细胞差异表达蛋白质组分析

为了研究伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)感染宿主细胞后宿主蛋白的差异表达情况,寻找PRV与细胞相互作用的重要分子,本试验将PRV接种PK-15细胞,运用同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)结合色谱/串联质谱联用技术,开展病毒感染细胞后差异表达蛋白分析,并通过qPCR对其数据进行验证。以未接毒细胞为对照,通过数据库检索,分析出3 062个蛋白,共鉴定到27个差异表达蛋白,其中21个蛋白下调,6个蛋白上调。这些差异蛋白主要参与代谢过程、生物调控、应激反应以及定位等生物学过程,具有结合活性、催化活性、转录活性等分子功能。NFκB1、PIK3R2、HSPA1L等差异蛋白在多条通路中发挥作用。POP1、UTP15和ND4的表达变化情况与iTRAQ结果变化趋势一致,证明了该数据的可靠性。本试验研究结果为进一步研究PRV致病机制及宿主免疫应答提供理论依据。     

12株H9N2亚型禽流感病毒与Sia-α-2,6-唾液酸受体结合力的变化研究

为分析H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)对Sia-α-2,6-唾液酸受体(Sia-α-2,6-Gal)结合力的变化趋势,选择2001~2013年分离自山东省的12株H9N2 AIV进行研究。利用同源建模、分子动力学和分子对接等计算方法,对12株H9N2 AIV的HA蛋白与Sia-α-2,6-Gal之间相互作用进行系统研究,筛选HA蛋白中与Sia-α-2,6-Gal结合的关键氨基酸,并对关键氨基酸进行饱和突变研究。结果显示:随着分离年代临近,H9N2 AIV对Sia-α-2,6-Gal亲和能力有增强趋势,Thr198、Leu234、Met235位点的某种氨基酸突变能够大幅提高HA蛋白与Sia-α-2,6-Gal的结合能力。推测H9N2 AIV对哺乳动物感染能力呈逐渐增强趋。     

猪14-3-3蛋白家族基因生物信息学分析

14-3-3蛋白在哺乳动物中均有表达,是一类高度保守的酸性蛋白家族,广泛参与各种信号传导途径,具有十分重要的功能。本研究以猪的14-3-3蛋白家族为研究对象,运用生物信息学方法,首先对猪(Sus scrofa)14-3-3蛋白家族基因组数据库进行搜素,获得猪14-3-3蛋白家族的7个亚型。然后通过对所有的猪14-3-3蛋白家族的DNA序列及各种表达序列标签(Expression Sequence Tags,ESTs)作进一步比对分析。结果表明:猪14-3-3蛋白家族的7个亚型在猪中均有表达;蛋白质多序列匹配分析表明猪14-3-3蛋白存在多个保守结构域,在各功能区段相当保守;通过基因结构分析、ESTs表达分析和蛋白质预测分析表明,14-3-3蛋白质家族均为亲水性蛋白,且不同亚型在猪体内不同组织表达,参与不同的生物学功能。本文将为猪14-3-3蛋白家族进一步的功能分析提供研究基础。     

能量负平衡奶牛血清的蛋白组学及生物信息学分析

目前集约化牛场高产奶牛产后乏情率较高,严重影响奶牛繁殖性能。尽管奶牛产后乏情发生机制已有较多报道,但奶牛产后能量负平衡所致的乏情血清蛋白组学机制尚不明确。本试验在黑龙江省某集约化牛场随即采取产后14～21 d奶牛,根据奶牛血液中β-羟丁酸的含量,按判定标准将试验奶牛分为能量正平衡组(NEB,n=60)和能量负平衡组(PEB,n=60),采集血清。应用iTRAQ/LC-MS/MS联用技术研究能量负平衡奶牛血清蛋白组学,获得23种差异表达蛋白。其中NEB组表达上调的有16种,分别为淀粉样结合蛋白A前体(SAA)、脂多糖结合蛋白前体(LBP)、骨膜素前体(POSTN)、Interα胰蛋白酶抑制剂重链H4前体(ITIH4)、细丝蛋白A(FLNA)、补体C2前体(C2)、蛋白酶体α亚基2型(PSMA2)、蛋白酶体亚基β1型前体(PSMB1)、蛋白酶体α亚基4型(PSMA4)、山梨醇脱氢酶(SORD)、蛋白酶体亚基α型-7(PSMA7)、血管紧张素原前体(AGT)、热休克蛋白HSP90-α(HSP90A1)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、精氨琥珀酸裂解酶(ASL)和血红素结合蛋白前体(HPX),表达下调的有7种Cathelicidin7前体(CAMP)、转甲状腺素蛋白前体(TTR)、多聚免疫球蛋白受体前体(PIGR)、载脂蛋白F(APOF)、核糖核酸酶4前体(RNASE4)、载脂蛋白A1前蛋白(APOA1)和载脂蛋白A5前体(APOA5)。这些差异表达蛋白多与脂类代谢和蛋白酶复合体系统相关,也与和糖酵解相关的SORD和GAPDH有关。     

一株低致病力H5N3亚型禽流感病毒的全基因组序列分析及其对小鼠的感染性研究

为了解H5N3亚型禽流感病毒(AIV)的生物学特性,本研究对从我国广西省鸭体内分离到的一株低致病力H5N3亚型AIV DK/GX/S11453/2019(H5N3)进行了全基因组序列分析、抗原性分析、对小鼠的感染性以及受体结合特性分析。全基因组序列分析显示,该病毒的基因具有明显的野鸟源性,该病毒除HA与NA来源相同外,其余片段均来源不同,具有明显的遗传多样性。HA蛋白的裂解位点仅含有一个碱性氨基酸,符合低致病力AIV的分子特征。抗原性分析结果显示该病毒分离株与近几年国内使用的各疫苗株的抗原差异性较大。小鼠感染性试验结果显示,该病毒对小鼠呈现低致病力,不引起小鼠明显的体质量下降,但可以在小鼠的肺脏和鼻甲内有效的复制。受体结合特性分析结果显示,该病毒具有同时结合α-2, 3和α-2, 6受体的能力,存在一定感染哺乳动物的风险。本研究通过对该H5N3亚型AIV部分生物学特性的分析,为H5N3亚型禽流感的防控提供理论依据。