水貂肠炎病毒静置和旋转细胞培养最适条件的筛选

用传代细胞系成功地培养了水貂肠炎病毒,并从敏感细胞系、接毒量、接毒时机、换液时机、收毒时机及营养液成分等方面进行了优选,确定了 MEV 的最适培养糸件,证明克氏瓶静置培养与大立瓶旋转培养规律一致,转瓶转速以2/15～1/6rpm 为宜.关于水貂肠炎病毒(MEV)组织培养方法的研究,迄今未见报道。本文旨在寻找提高 MEV 增殖滴度的组织培养方法。     

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID_(50))的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID_(50)绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID_(50)、鸡胚半数感染量(EID_(50))与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10~(6.375) EID_(50),细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID_(50)值为10~(7.0)/0.1 mL,EID_(50)为10~(7.5)/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。     

猫细小病毒病研究进展

猫泛白细胞减少症病毒(FPLV),是细小病毒科,细小病毒亚科,牛犬细小病毒属成员[1]。19世纪初,FPLV首次出现,但感染对象只限于猫和小鼠,而且病毒对感染动物的致死率不高。19世纪40年代,一种与FPLV感染极为相似的疾病在水貂中暴发,引起80%的水貂发病死亡,此后这种疾病迅速呈全世界蔓延趋势,在美国等许多国家发现引起水貂发病的病毒,命名为水貂肠炎病毒(MEV)。19世纪70年代后期,继FPLV和MEV后另一种"新"病毒在犬中出现,犬细小病毒(CPV),这种病毒被命名为CPV-2。此后,CPV-2在猫、犬中不断变异,出现了CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c抗原型。自此,FPLV、CPV、MEV之间关系引起了研究人员的关注,成为了研究的焦点。对3个相似病毒宿主范围的变化、DNA序列的差异性和变异性以及日后CPV出现新抗原型病毒的研究也相应开始。不仅如此,对3种病毒之间是否存在特殊的亲缘关系也提出质疑,在探讨中提出不同的流行机制假说。现在对猫细小病毒引起的疾病在临床症状、流行状况、致病机理和疫苗的研制开发都取得了一定成绩,应用疫苗基本控制了FPLV、CPV、MEN引起的爆发性疾病。     

重组H5N3禽流感疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖条件研究

为研究通过反义遗传学技术构建的重组禽流感病毒rH5N3疫苗株在MDCK细胞中大规模增殖规律，确定最佳增殖条件，将rH5N3疫苗株分别在500mL和10L转瓶培养的MDCK细胞中进行增殖试验，检测不同接毒量以及接毒后不同时间里的血凝价，以确定病毒的增殖情况。结果表明，在确定的最佳病毒增殖条件下，该重组rH5N3疫苗株在500mL转瓶和10L转瓶中可获得大量增殖，病毒的最高血凝价均可达到1：1024。rH5N3疫苗株可以在MDCK细胞中大规模增殖，操作方法简便，成本低廉，该方法为禽流感细胞培养型疫苗的大规模生产奠定了基础。     

犬细小病毒YA-16-C66株纸片载体培养工艺优化及其与转瓶培养工艺的比较分析

采用微型生物反应器确定纸片载体上F81细胞最佳的接种密度和最佳接毒剂量,在NBS反应器中验证温度对犬细小病毒YA-16-C66株增殖的影响。经过三次重复试验,确定利用NBS生物反应器培养犬细小病毒YA-16-C66株最佳工艺为：采用同步接毒法,培养基为含1%新生牛血清的199溶液,细胞接种密度为1.5×10_⁷cells/g,接毒剂量为0.05 MOI,在pH7.2条件下,37.0℃培养48h后降温到35.0℃继续培养24-48小时,细胞病变达到80%~90%时收获上清液。三批次反应器与转瓶工艺产品比较,结果表明：反应器比转瓶收获液病毒含量高1.1~1.9 lg TCID₅₀/100μL;相同培养面积,反应器所得病毒总量是转瓶所得病毒总量的2.8-18.5倍。     

猪圆环病毒2型片状载体悬浮培养生产工艺研究

为了提高猪圆环病毒2型(PCV2)抗原的病毒含量,对PCV2片状载体悬浮培养生产工艺进行了试验。将PCV2接种到PK-15细胞悬液中,在转瓶上培养,第2次带毒传代后,接种到片状载体上悬浮培养,当培养液中耗糖量稳定时,换维持液,每48 h收获1次,可以连续收获5次以上,有效抗原含量比传统转瓶生产工艺提高了5～10倍。     

猪圆环病毒2型在转管微载体培养PK-15细胞中增殖动态

为提高猪圆环病毒2型(PCV2)的增殖规模及单位体积内的病毒滴度,本研究利用转管微型反应器,采用荧光定量PCR检测方法,对PCV2在PK-15细胞中复制特性和增殖动态进行了系统研究。结果显示,转管(内置0.6 g纸片载体)中接种约2.98×107个DF-1细胞,培养7 d细胞增至1.93×108~2.0×108个,并确定培养7 d时为最佳接毒时间;病毒的最佳接种剂量为120.8 MOI,最佳收毒时间为接毒后的100 h,可达5.53E+06以上。细胞数增长与糖耗间呈明显平行关系,在细胞生长期内(168 h)平均每个细胞耗糖量为3.09×10-8g/24 h,可以根据糖耗量的多少推测细胞生长状态和数量。相同培养液中利用转管微型反应器培养PK-15细胞生产PCV2最终获得的病毒液毒价比转瓶培养毒价提高1.65倍。本实验为PCV2在生物反应器中大规模培养提供了参考依据。     

猪乙型脑炎病毒转瓶培养工艺的研究

为了确定猪乙型脑炎病毒转瓶中培养的关键技术参数,对猪乙型脑炎病毒(SA14-14-2株)转瓶培养工艺进行研究,试验以Vero细胞、3 L转瓶培养病毒,通过对接种时间、接毒量、吸附时间、吸附温度、维持液pH值、维持培养温度、培养时间、维持液血清浓度和转瓶机转速9个条件的优化,将繁殖的病毒液冻融一次,采用病毒蚀斑数测定方法测定繁殖病毒效价。结果表明:用3 L转瓶进行培养,将Vero细胞培养至72～96 h进行病毒接种,接种量为1 200万pfu/mL的毒液3 mL,病毒吸附温度为37℃,吸附时间为60 min,吸附后用pH值为7.8、含2%胎牛血清的维持液继续培养,35℃、12 r/h旋转培养至96 h后收获毒液,冻融一次,可获得较高的效价(不低于1×10~7 pfu/mL)。说明上述条件可应用于猪Ⅰ型脑炎病毒的转移培养。     

猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(CH-1R株)工厂化生产培养条件的研究

为提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)活疫苗CH-1R株的产量和疫苗的质量,本实验探索了PRRSV活疫苗CH-1R株在MARC-145细胞中大规模生产培养的最佳条件。将CH-1R株分别在3L和10L转瓶培养的MARC-145细胞中进行增殖试验,分析CH-1R株在不同接种病毒量和不同接种病毒时间的TCID50变化规律。结果表明,在3L和10L转瓶中,病毒的TCID50最高可达到107.0TCID50/mL以上。CH-1R株通过转瓶在MARC-145细胞中大规模增殖,为PRRSVCH-1R株的工厂化生产奠定了基础。     

FPLV、CPV、MEV非结构蛋白NS1和结构蛋白VP2遗传特征分析

为了解猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)、犬细小病毒(CPV)、水貂肠炎病毒(MEV)氨基酸遗传演化规律,探索细小病毒在不同种属动物间跨种传播过程中病毒蛋白氨基酸差异特点以及毒株流行病学特征.通过搜集确定为CPV、MEV的粪便病料,PCR扩增克隆非结构蛋白NS1和结构蛋白VP2基因,并参考GenBank中其他细小病毒毒株...     

鸡新城疫病毒LaSota株在BHK-21细胞上增殖条件的优化

本研究旨在对鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)LaSota株在BHK-21细胞上的增殖条件进行优化,为实现应用细胞系生产NDV提供参考。在确定BHK-21细胞TPCK-胰酶耐受浓度的基础上,在培养基中添加不同浓度的TPCK-胰酶、新生牛血清及调节不同pH,通过对细胞培养液细胞半数感染量(TCID₅₀)的测定,确定最适胰酶浓度、血清浓度及pH;通过固定接毒量而添加不同数量细胞或固定细胞数量而接种不同量的病毒,确定最适细胞量及接毒量;将BHK-21细胞接种NDV LaSota株后,通过测定不同时间细胞上清液TCID₅₀绘制增殖曲线,确定最佳收毒时间;应用转瓶对该病毒进行扩大培养,并进行TCID₅₀、鸡胚半数感染量(EID₅₀)与血清凝集价(HA)的测定。结果显示,NDV LaSota株在BHK-21细胞上增殖的最适TPCK-胰酶浓度为3μg/mL,最适接毒量为10^6.375 EID₅₀,细胞数量为1×10~6个,培养基pH为7.2,且可用无血清培养基进行培养,BHK-21细胞接种NDV LaSota株后最佳收毒时间为34～36 h。应用BHK-21细胞采用转瓶培养的方式对NDV LaSota株进行增殖,结果显示,细胞培养液TCID₅₀值为10^7.0/0.1 mL,EID₅₀为10^7.5/0.1 mL,HA效价为1∶256。因此,应用以上条件增殖培养NDV LaSota株,完全适用于该病毒的规模化生产,且符合现行的兽医生物制品与检验制造规程。     

水貂病毒性肠炎病毒在猫肾细胞上培养过程中补增细胞对病毒滴度的影响

笔者在F81-KL细胞培养MEV过程中,通过比较在不同时间(72 h~96 h)添加不同细胞数对MEV滴度的影响,探讨添加细胞的实际效果和经济价值。结果表明:MEV在培养过程中,72 h~96 h按8×104个/cm~2添加新鲜细胞可提高病毒滴度,添加的细胞数对产量影响不明显。说明在MEV培养过程中人为添加敏感细胞在到一定程度上可提高病毒滴度并可稳定收获。     

维持液中有无血清培养细小病毒的比较

维持液中不加血清不降低 MEV 在猫肾细胞系(F_(81)株和 C_(81)株)上的培养效价。MEV 在 C_(81)株猫肾细胞系上培养特性(HA 和 CPE)的变化规律不因维持液中不加血清而受影响.应用无血清维持液在猫肾细胞系上长期传代培养 MEV,病毒的高增殖率和强免疫原住不受影响,未发现有不良的远期效应出现。MEV 培养的无血清维持液用于病毒抗原的大批量生产取得成功,为研制安全性更高的细小病毒疫苗奠定了基础,为组织培养细小病毒的纯化和精制提供了方便.     

水貂病毒性肠炎免疫荧光抗体试验的研究

水貂病毒性肠炎(MVE)是由水貂细小病毒引起的急性致死性传染病。最早由F.Sehofield(1949)在加拿大首次发现。随后美洲、欧洲及日本各主要养貂国均有发生。据C.Will等(1952)报道,水貂肠炎病毒(MEV)和猫泛白细胞减少症病毒(FPLV)有密切的亲缘关系。     

草鱼出血病细胞培养灭活疫苗生产工艺的比较

比较了方瓶静置培养、１０×２００ｍｌ转管培养和细胞生物反应器微载体培养３种方法增殖细胞和病毒的效率,以细胞生物反应器微载体培养法的效率最高,与静置培养法相比较,单位培养液细胞增殖量提高２０～２５倍,病毒增殖量ＴＣＩＤ５０测定增加１．６５对数值,ＬＤ５０测定增加１．４５对数值。经济效益比较,疫苗制备的培养液成本,以细胞生物反应器微载体培养法最低。已研究出以细胞生物反应器微载体培养法增殖细胞和病毒为基本生产工艺的工厂化生产草鱼出血病细胞疫苗工艺流程。     

猪瘟疫苗微载体悬浮培养生产工艺试验

为优化猪瘟病毒(CSFV)的BT细胞悬浮培养工艺以提高CSFV抗原含量,采用2 L生物反应器对BT细胞的最佳接种密度、CSFV的最佳接种剂量进行了摸索和优化,采用优化的工艺参数,进行了BT细胞5倍消化放大工艺验证,同时对比了BT细胞悬浮培养工艺与转瓶培养工艺增殖CSFV的差异。结果表明,在3 g/L微载体浓度下,采用1.5×10~5个/mg的细胞初始接种密度,培养72 h可获得最佳细胞密度;采用MOI(感染复数)为0.5的接种剂量可收获≥106.8FAID_(50)/mL的CSFV抗原;BT细胞从2 L到10 L生物反应器的5倍消化放大工艺验证试验,3批细胞培养96 h均能达到4.0×10~6个/mL以上;悬浮培养工艺增殖的CSFV抗原含量约是转瓶培养工艺的15倍。以上试验为猪瘟疫苗的生物反应器规模化生产奠定了基础。     

应用Cephodex微载体悬浮培养DF-1细胞增殖水貂犬瘟热病毒

为准确把握Cephodex微载体及其悬浮培养技术在水貂犬瘟热病毒增殖中的特点优势,本试验对微载体培养与单层静置培养2种方法中的细胞密度与病毒滴度进行了检测,同时对5,10,15 g/L 3种不同微载体质量浓度下的细胞生长与病毒增殖效果作了比较分析.结果 显示,微载体培养法与单层静置培养法比较,DF-1细胞密度可提高3倍...     

应用Cephodex 微载体培养DF-1细胞增殖水貂源犬瘟热病毒的技术研究

为了建立水貂源犬瘟热病毒(CDV)的大规模悬浮培养技术，实现细胞高密度生长和病毒高效增殖，本研究应用Cephodex微载体悬浮培养鸡胚成纤维细胞系DF-1细胞，增殖弱毒株CDV3。整个过程采用摇瓶培养法，通过对病毒培养温度、病毒收获时间等关键技术条件进行优化，确立最佳培养条件。结果表明，DF-1细胞37℃培养至72 h,接种CDV3,35℃继续培养72 h收获病毒，病毒滴度每0.1 mL可达10^5.0 TCID₅₀。CDV微载体悬浮培养技术的初步建立，为高效水貂犬瘟热疫苗的研发生产奠定了重要的基础。     

猪瘟兔化弱毒细胞疫苗的深液倾斜旋转培养与增液培养试验

1、用增加培养液量(3—4倍)旋转法培养猪瘟弱毒细胞疫苗,第一收、第二收病毒收获液的毒价均可达到普通旋转培养法的滴度。二收的绝大多数批次毒价用兔检5万倍通过,符合制苗要求。 2、用深液(培养液量增加7—8倍)倾斜旋转法培养猪瘟弱毒细胞疫苗。第一收与第二收的毒液或培养7天一次全收的毒液,其大多数试验批次毒价均可达到制苗标准。 3、用深液(培养液量增加8倍)倾斜旋转通气法培养猪瘟弱毒细胞疫苗,接毒后培养7天一次全收毒液,大多数批次试验毒价用兔检5万倍通过。符合制苗要求。以上三种培养方法所得资料说明提高猪肾细胞产毒量是明显的,工艺是简便的,在生产上是可行的。对细胞提高繁殖病毒能力的问题进行了某些探索。     

激流灌注式生物反应器培养猪瘟活疫苗工艺的研究

为建立规模化培养猪瘟活疫苗的生产工艺,本研究利用工作体积为10L的激流灌注式生物反应器培养猪睾丸细胞(swine testis,ST),接种猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)进行培养研究。研究结果显示,培养4 d细胞数可增长5~7倍,接种病毒后15 d可收获毒液6次,收获量至少与200个10 L转瓶单次收获量相当,产品各项检测均合格。本工艺极大地缩短了培养时间,为规模化培养工艺的推广与使用提供了技术参数。