甘肃省高寒草原牧草孢囊线虫的鉴定

2013年8月下旬,对甘肃天祝高寒草甸草原孢囊线虫发生情况进行调查,从嵩草和矮嵩草根部和根际土样中分离得到孢囊线虫。通过对孢囊和孢囊阴门锥的形态观察,初步鉴定为禾谷孢囊线虫(Heterodera avenae)。其特征为孢囊浅褐色,阔柠檬形,阴门锥双膜孔,未见阴门下桥,泡状突明显。利用通用引物AB28和TW81对其群体rDNA-ITS区进行PCR扩增和序列测定,得到ITS区序列长度为1045 bp。将所测得序列在Genbank和Blast上比对,结果显示,此禾谷孢囊线虫群体与H. avenae群体相似度达99%~100%。进一步证实寄生于甘肃天祝高寒草甸草原嵩草和矮嵩草的孢囊线虫均为H. avenae,这是首次报道莎草科嵩草和矮嵩草也是禾谷孢囊线虫的寄主。     

林麝捻转血矛线虫的分子鉴定

为鉴定林麝粪样中疑似血矛属线虫虫卵的虫种,本研究提取四川和陕西地区林麝粪样中疑似血矛属线虫的虫卵DNA,对其核糖体内转录间隔区(ITS)全序列进行PCR扩增与序列分析。结果显示14个疑似血矛属线虫的虫卵DNA样品ITS全序列片段大小为786 bp~788 bp,序列相似性为99.0%~100%;经序列BLAST比对和系统发育分析,所有疑似血矛属线虫的虫卵样品均为捻转血矛线虫,与NCBI基因库中多株捻转血矛线虫的ITS序列相似性为97.0%~99.5%。研究结果表明,寄生于林麝的血矛属线虫为捻转血矛线虫,从而为控制林麝捻转血矛线虫病提供了重要依据。     

内生真菌对醉马草根际土壤线虫群落的影响

为明确内生真菌对醉马草根际土壤线虫群落特征的影响,于2014年6,8和10月,对带内生真菌和不带内生真菌醉马草根际土壤进行采样,利用淘洗-过筛-蔗糖离心法分离线虫,根据线虫形态学特征进行鉴定,结果表明,本研究共捕获土壤线虫11889条,分别隶属于线虫动物门2纲6目22科37属,带内生真菌醉马草根际土壤线虫个体密度高于不带内生真菌醉马草,而类群数、多样性指数(H')、均匀度指数(J)和丰富度指数(SR)均低于不带内生真菌醉马草,但处理间差异不显著,表明尽管内生真菌使醉马草根际土壤线虫个体密度有所增加,使类群数有所降低,但是内生真菌的存在对醉马草土壤线虫多样性没有影响;与不带内生真菌醉马草相比,带内生真菌醉马草根际土壤线虫MI指数显著升高,而PPI指数和PPI/MI值显著降低,表明内生真菌在一定程度上确实改变了土壤线虫功能类群组成,其中主要影响植物寄生线虫。     

高羊茅根际一种短体线虫的分离与鉴定

高羊茅(Festuca elata)是草坪草中绿期最长的一个草种,在草坪建植中具有重要作用。一些病害随着高羊茅种植范围的不断扩大而逐渐频发,对草坪造成极大经济损失。本研究通过调查北京市高丽营镇高羊茅斑块状枯死的原因发现,导致高羊茅枯死的是高羊茅根际优势植物寄生线虫。采用贝尔曼漏斗法分离了侵染北京地区高羊茅上的线虫,结合唇环、受精囊、食道、V值等形态学鉴定方法,证明高羊茅草根际优势植物的寄生线虫均为一种短体线虫,确定为斯克里步纳短体线虫(Pratylenchus scribneri)。线虫ITS和28S序列的PCR扩增及Gen Bank序列比对后发现,其与国外发现的P.agilis及P.scribneri序列相似度为93%,亦确证该线虫为斯克里步纳短体线虫。     

美国多花黑麦草种子中致死粒线虫的检疫鉴定

致死粒线虫(Anguina funesta)是具有重要经济意义的粒线虫，被多国列入检疫性有害生物名录。2021年，上海口岸从来自美国的多花黑麦草(Lolium multiflorum)种子中截获一种粒线虫属线虫，但在该样品中仅分离得到幼虫，无法准确鉴定。本研究运用形态学与分子生物学相结合的方法对分离得到的幼虫进行鉴定。采用28S通用引物扩增该线虫序列，测序获得742 bp的序列，与GenBank中登录的致死粒线虫相似性达100%；采用ITS通用引物对ITS区扩增并测序，获得778 bp的序列，与GenBank中登录的致死粒线虫相似性达99.86%～100%。基于28S及ITS区序列构建的系统进化树均显示，该线虫与致死粒线虫位于同一进化枝上。综合形态学特征及分子鉴定结果，将该群体鉴定为致死粒线虫。这是我国口岸首次报道截获该线虫，本研究将为口岸检疫部门鉴定该线虫提供技术参考。     

山羊美丽筒线虫ITS序列的PCR扩增及分析

以神木山羊体内分离出的美丽筒线虫为研究对象,用保守引物进行PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)和5.8S序列,并进行克隆、转化、测序和序列分析,对样品进行分子鉴定.结果获得一个美丽筒线虫样品的ITS及5.8 S rDNA序列,总长均为1 035 bp.将序列与GenBankTM公布的相关序列进行比较分析,结果显示美丽筒线虫分离株ITS1与参考株的相似性为98.1％～99.7％,ITS2、5.8S序列与参考株相似性均达到100％.本研究是第一次从山羊体内获得美丽筒线虫ITS序列,为其分子学的进一步研究提供了基础资料.     

细口杯环线虫形态学和分子特征分析

为探讨细口杯环线虫(Cylicocyclus leptostomum)的分类地位和系统发育关系,本试验利用数码显微镜对细口杯环线虫进行了形态观察,运用PCR扩增其核糖体DNA内部转录间隔区(rDNA-ITS)序列,并从GenBank中下载12种圆线虫的ITS序列,以马圆形线虫(Strongylus equinus)为外群,运用最大似然法(maximum likelihood,ML)构建系统发育树。结果显示,细口杯环线虫中等大小,口囊呈圆柱形,宽度大于深度,口囊底部有小齿;口囊壁前端薄,后端基部有明显的环箍形增厚;外叶冠由20～24个小叶组成,内叶冠由50～60个小叶组成;食道漏斗较小;雄虫生殖锥较长,呈圆锥形;雌虫尾部直,尾尖呈指形;所测ITS序列总长度为837bp,其中ITS1长366bp,5.8S长153bp,ITS2长318bp;ITS1的GC含量(46.0%)明显高于ITS2(39.8%);经BLAST同源性比对分析,本研究线虫ITS序列与GenBank上登录的同种线虫序列(登录号:AJ004849、Y08587)同源性达99.85%,与阿氏杯环线虫的同源性达99.0%,与杯环属内其他线虫的同源性仅为93.33%～98.45%;ITS序列种间差异远大于种内差异;系统进化分析显示,细口杯环线虫与阿氏杯环线虫的亲缘关系较近,而与杯环属内其他线虫的亲缘关系相对较远。综上所述,ITS序列可作为鉴定寄生线虫的分子遗传标记,证实所采标本是细口杯环线虫,并首次在国内报道了细口杯环线虫的ITS序列,为该线虫的进一步研究奠定基础。     

广州桑园桑树根结线虫的形态学与分子鉴定

桑树根结线虫病是华南蚕区危害严重的土传病害之一.针对华南蚕区桑园根结线虫危害普遍发生的现状,对采自华南蚕区的桑园桑根结线虫病样进行了病原线虫的分离与形态学观察,并对其rDNA、CO Ⅰ基因分别进行了测序和系统发育分析,同时在基于桑根结线虫特异分子检测基础上进行了线粒体全基因组的测序比较.结果 表明,广州桑园桑根结线虫病样分离的根结线虫具有典型的象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)的形态特征;其rDNA与CO Ⅰ基因序列与已报道的象耳豆根结线虫序列一致性均高达99％以上;rDNA与CO Ⅰ的进化树分析发现其与象耳豆根结线虫同源序列均聚在同一枝;PCR的特异性检测结果表明,只有象耳豆根结线虫的特异性引物扩增,获得236 bp的目的 条带;线粒体全基因组序列全长为17080 bp(GenBank收录号:MW186714),与GenBank唯一报道的象耳豆根结线虫M.enterolobii(KP202351.1)一致性达99.7％.基于上述的生物学观察和分子生物学研究结果,认为广州桑园的桑根结线虫病病原为象耳豆根结线虫M.enterolobii,这为桑树桑根结线虫病的发生和防控提供了实验参考.     

细口杯环线虫形态学和分子特征分析

为探讨细口杯环线虫(Cylicocyclus leptostomum)的分类地位和系统发育关系,本试验利用数码显微镜对细口杯环线虫进行了形态观察,运用PCR扩增其核糖体DNA内部转录间隔区(rDNA-ITS)序列,并从GenBank中下载12种圆线虫的ITS序列,以马圆形线虫(Strongylus equinus)为外群,运用最大似然法(maximum likelihood,ML)构建系统发育树。结果显示,细口杯环线虫中等大小,口囊呈圆柱形,宽度大于深度,口囊底部有小齿;口囊壁前端薄,后端基部有明显的环箍形增厚;外叶冠由20～24个小叶组成,内叶冠由50～60个小叶组成;食道漏斗较小;雄虫生殖锥较长,呈圆锥形;雌虫尾部直,尾尖呈指形;所测ITS序列总长度为837bp,其中ITS1长366bp,5.8S长153bp,ITS2长318bp;ITS1的GC含量(46.0%)明显高于ITS2(39.8%);经BLAST同源性比对分析,本研究线虫ITS序列与GenBank上登录的同种线虫序列(登录号:AJ004849、Y08587)同源性达99.85%,与阿氏杯环线虫的同源性达99.0%,与杯环属内其他线虫的同源性仅为93.33%～98.45%;ITS序列种间差异远大于种内差异;系统进化分析显示,细口杯环线虫与阿氏杯环线虫的亲缘关系较近,而与杯环属内其他线虫的亲缘关系相对较远。综上所述,ITS序列可作为鉴定寄生线虫的分子遗传标记,证实所采标本是细口杯环线虫,并首次在国内报道了细口杯环线虫的ITS序列,为该线虫的进一步研究奠定基础。     

猪毛尾线虫的检测及其ITS序列分析

毛尾线虫俗称鞭虫,为肠道常见寄生线虫,可感染人和多种动物。2015年11月,江西某猪场育肥猪出现腹泻症状,粪便带黏液和血液,部分病猪死亡;剖检发现猪肠道内充满了线状虫体;依据发病猪症状和虫体、虫卵的分析,初步确定该病为猪毛尾线虫病。采用通用引物扩增分离线虫的基因组内转录间隔区(internal transcribed spacer,ITS),结果显示分离虫体的ITS序列与猪毛尾线虫ITS序列的核苷酸同源性高达99.8%,从基因水平进一步证实了该病原为猪毛尾线虫;系统进化分析表明其与18条来自不同地区毛尾线虫的ITS序列相似性均93.5%,其中,与湖南益阳地区的猪毛尾线虫(AM993005)亲缘关系最近。试验结果为建立猪毛尾线虫的分子生物学诊断方法奠定了基础。     

犬皮肤癣菌病病原的分离及其ITS区序列分析

分离一例格力犬皮肤癣菌病的病原,并对其ITS区序列进行分析,以确定其种属。用沙氏培养基对病料进行分离、培养,根据菌落形态特征与镜检结果对分离到的病原菌进行初步鉴定,采用真菌鉴定通用引物ITS1及ITS4对分离菌的ITS区序列进行PCR扩增、测序,将测序结果进行对比分析,并对其亲缘关系进行系统发育分析。分离到的病原菌经形态学鉴定,被初步判定为小孢子菌属真菌,其ITS区序列与Gen Bank中的犬小孢子菌(ATCC 36299)的ITS序列(FJ 385030.1)相似性为99%,且在系统发育树上属同一分支。结果表明,引起该犬皮肤癣菌病的病原菌为犬小孢子菌。     

四川地区鸡异刺线虫核糖体转录间隔区(ITS1/2)序列的遗传变异分析

探讨四川地区鸡异刺线虫(Heterakis gallinarum)的遗传变异情况,为该地区鸡异刺线虫病的流行特征及防控提供基础资料。采用PCR扩增四川7个地区共59个鸡源鸡异刺线虫核糖体ITS1-5.8S-ITS2片段并测序,所得序列剪切5.8S序列后,得到ITS1/2序列,并分析ITS1/2序列的遗传多样性;同时利用GenBank中已公布的异刺属(Heterakis)ITS1/2序列信息,进行系统发育研究。结果如下:59条鸡异刺线虫ITS1/2序列相似性较高(98.9%~100.0%),ITS1序列间变异较ITS2大;59条序列有20个变异位点和14个单倍型(H1~H14);四川种群具有丰富的单倍型多样性(Hd=0.532)和较低的核苷酸多样性(π=0.000 94);种群间基因交流频繁(Nm=31.72),群体遗传分化不明显(Fst=0.007 82),以群体内变异为主(AMOVA分析值=99.22%);从单倍型网络图及进化树(MP和ML)分析来看,7个地理种群未形成显著的地理种群结构,但四川整体种群曾经历过种群扩张(Tajima’s D=-2.553 31,Fu’s Fs=-10.564;P0.05);进化树(MP和ML)能有效区分鸡异刺线虫与属内其他虫种。四川7个地区鸡的鸡异刺线虫基因交流频繁,遗传多样性较低。     

白鹈鹕体内对盲囊线虫种类的鉴定及其ITS序列分析

为了鉴定从广东某地圈养的白鹈鹕体内的线虫种类,2个样本通过形态学观察初步鉴定为对盲囊线虫后,对虫体核糖体DNA（rDNA）内转录间隔区ITS-1、ITS-2及5.8SrDNA序列进行扩增和测序,并与GenBankTM公布的序列进行比对,构建系统发育树分析,确定其种类.结果显示,白鹈鹕体内线虫符合对盲囊线虫的形态学特征,其ITS-1序列长度为463 bp,与Contracaecum sp.（GenBankTM登录号：KF990496.1）ITS-1的序列相似性分别为98.9％、99.8％;ITS-2序列长度分别为288-289 bp,与C.bancrofii（GenBankTM登录号：FM177887.1）的ITS-2序列的相似性分别为96％、95％;5.8SrDNA序列长度为157 bp.通过以ITS-1序列为分子标记的系统发育树分析,白鹈鹕体内线虫与C.bancrofti属同一分支,应为C.bancrofii.形态学鉴定方法结合ITS序列分析可以准确鉴定白鹈鹕体内线虫的种类,为其他线虫的快速准确鉴定提供参考.     

兔皮肤病原真菌的分离及其ITS序列的分析鉴定

【目的】分离发病兔场皮肤真菌病的病原,并对其ITS序列进行分析鉴定。【方法】采集病兔患病部位的皮屑、结痂进行培养,并根据形态学的特点进行鉴定;然后采用真菌ITS区通用引物对其ITS区进行PCR扩增测序,并将其ITS区序列与Gen Bank中的核酸数据库进行比对分析,确定病原真菌的生物学分类,最后对其亲缘关系进行系统发育分析。【结果】分离得到的病原真菌经形态学初步鉴定为小孢子菌属;序列比对和系统发育分析表明,该菌与Microsporum gypseum strain WCH-MG001(序列号:GU348990.1)的ITS序列具有99%的同源性,在系统发育树上也属于同一分支,从而确定该菌为石膏样小孢子菌。     

兔皮肤病原真菌的分离及其ITS序列的分析鉴定

本试验的目的是分离发病兔场皮肤真菌病的病原,并对其ITS序列进行分析鉴定。采集病兔患病部位的皮屑、结痂进行培养,并根据形态学的特点进行鉴定;然后采用真菌ITS区通用引物对其ITS区进行PCR扩增测序,并将其ITS区序列与GenBank中的核酸数据库进行比对分析,确定病原真菌的生物学分类,最后对其亲缘关系进行系统发育分析。结果显示:分离得到的病原真菌经形态学初步鉴定为小孢子菌属;序列比对和系统发育分析表明,该菌与Microsporum gypseum strain WCH-MG001(序列号:GU348990.1)的ITS序列具有99%的同源性,在系统发育树上也属于同一分支,从而确定该菌为石膏样小孢子菌。     

一种异尖科线虫rDNA-ITS序列的PCR扩增及分析

以日本进境的冻鳕鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,用保守引物PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)和5.8S序列,并进行克隆、转化和序列分析,对样品进行分子鉴定。结果获得2个异尖科线虫样品的ITS及5.8 S rDNA序列,总长为991 bp,样品间序列相似性为99.0%。将序列与GenBank公布灰海鳗对盲囊线虫(Contracaecum muraenesoxi)的相关序列进行比较分析,结果显示与C.muraenesoxi的ITS1、5.8S和ITS2序列相似性高,分别98.0%～98.4%、100%和97.0%～98.0%,表明冻鳕鱼中分离的异尖科线虫属于C.muraenesoxi。     

进境太平洋鳕鱼寄生的异尖科线虫rDNA-ITS 序列的PCR扩增及分析

以日本进境的冻太平洋鳕鱼体内分离出的异尖科线虫为研究对象,采用寄生虫通用引物NC5和NC2扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)序列,进行克隆、转化、测序和序列分析,并对样品进行分子鉴定。结果表明,扩增的异尖科线虫样品的ITS序列片段大小为906 bp,包含部分的18S、28S及全部的ITS1(353 bp)、5.8S(157 bp)和ITS2(299 bp)序列,ITS1和ITS2序列与GenBank登录的伪新地蛔线虫(Pseudoterranova decipiens)同源性均为在99.7%以上,与其他线虫的相似性较低。由ITS1和ITS2序列构建的系统进化树可知,从鳕鱼中分离到的线虫ITS1和ITS2均与伪新地蛔线虫处于同一分支。本研究结果为异尖科线虫种属的确定及进一步的分子生物学研究奠定基础。     

犬隐球菌病病原分离与ITS区序列分析鉴定

为确定引起格力犬皮肤病发生的病原菌种属并提供科学的诊治方案,从病犬发病部位真皮层刮取病料,采用沙氏培养基对病料进行分离、培养,根据菌落形态特征与镜检结果对分离到的病原菌进行初步鉴定。采用真菌鉴定通用引物ITS1及ITS4对分离菌的ITS区序列进行PCR扩增、测序,将测序结果与GenBank中的新生隐球菌进行比对分析并构建系统发育树。结果表明,分离到的病原菌经形态学鉴定初步判定为隐球菌属真菌,其ITS区序列与GenBank中的新生隐球菌（JN939462.1和JN939461.1）的ITS序列相似性为99%,且在系统发育树上属同一分支,提示引起该犬隐球菌病的病原菌为隐球菌属新生隐球菌。     

草原3号杂花苜蓿根围植物寄生线虫种类及数量的研究

为了解草原3号杂花苜蓿(Medicago varia Martin.cv.Caoyuan No.3)根围植物寄生线虫的种类、数量及分布规律,试验采用五点取样法对条播草原3号杂花苜蓿根际、行间及休闲地植物寄生线虫种类及数量进行统计分析。结果表明:分离到的植物寄生线虫有散香属(Beleodorus)、柄端球属(Paurodontus)、环属(Criconema)、针属(Paratylenchus)、短体属(Pratylenchus)、垫刃属(Tylenchus)、裸矛属(Psilenchus)、盘旋属(Rotylenchus)、螺旋属(Helicotylenchus)、矮化属(Tylenchorhynchus)、头垫刃属(Tetylenchus)、长针属(Longidorus)等12个属,其线虫c-p值主要分布在2～3之间;1 cm～≤10 cm土层中优势属的属数分布为行间根际及休闲地,植物寄生线虫的属数及总数量分布均为根际行间休闲地;不同土层植物寄生线虫数量均为1 cm～≤10 cm土层大于10 cm～≤20 cm土层。说明草原3号杂花苜蓿植物寄生线虫的分布具有趋根性及表聚性。     

斑鼻羚毛首线虫ITS序列的PCR扩增及分析

以茂名野生动物园斑鼻羚体内分离出的毛首线虫为研究对象,用保守引物PCR扩增其核糖体DNA(rDNA)的内转录间隔区(ITS)和5.8 S序列,并进行克隆、转化、测序和序列分析,对样品进行分子鉴定.结果获得2个毛首线虫样品的ITS及5.8 S rDNA序列,总长为1 316 bp,样品间序列相似性为99.2%.将序列与G...